图1.通过splinkerette PCR（改编自Potter和Luo，2010）中转基因整合的方法的图谱表示

材料和试剂

自由生活的成虫蠕虫
基因组DNA提取
Gentra Puregene Tissue Kit（QIAGEN），包括
1. 细胞裂解液（目录号：8304295）
2. 蛋白沉淀溶液（目录号：8273807）
3. DNA水合溶液（目录号：8274043）
用于消化和治疗的酶
限制酶包括BstY I，BamH I和Bgl II（New England Biolabs）其他包括虾碱性磷酸酶（United State Biological，目录号：P4071-05）和外切核酸酶I（New England Biolabs，目录号：M0293S）
连接试剂
10x连接酶缓冲液和T4连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）
PCR试剂
5x Phusion高保真缓冲液，Phusion HF DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0530S）
寡核苷酸和引物
表1中详述的寡核苷酸必须合成，
所有序列来自Potter和Luo（2010），表S13
TE缓冲液（New England Biolabs，目录号：E6293）
10x NEB缓冲区2

1％琼脂糖凝胶

Oligo或Primer	序列
SPLNK-BOT	5'-CGAAGAGTAACCGTTGCTAGGAGAGACCGTGGCTGAATGAGACTGGTGTCGACACTAGTGG-3'
SPLNK-GATC-TOP	5'-GATCCCACTAGTGTCGACACCAGTCTCTAATTTTTTTTTTCAAAAAAA-3'
SPLNK＃1	5'-CGAAGAGTAACCGTTGCTAGGAGAGACC-3'
SPLNK＃2	5'-GTGGCTGAATGAGACTGGTGTCGAC-3'
3'SPLNK-PB＃1	5'-GTTTGTTGAATTTATTATTAGTATGTAAG-3'
5'SPLNK-PB＃1	5'-ACCGCATTGACAAGCACG-3'
3'SPLNK-PB＃2	5'-CGATAAAACACATGCGTC-3'
5'SPLNK-PB＃2	5'-CTCCAAGCGGCGACTGAG-3'
3'SPLNK-PB-SEQ	5'-ACGCATGATTATCTTTAAC-3'
5'SPLNK-PB-SEQ	5'-CGACTGAGATGTCCTAAATGC-3'

表1. 用于piggyBac转座子介导的转基因整合的splinkerette PCR作图的寡核苷酸和引物

设备

PCR热循环仪（Mastercycler Personal，Eppendorf）
凝胶电泳
凝胶文件（FOTODYNE，型号：FOTO/Analyst FX）

程序

从在22℃下温育48小时的新鲜宿主粪便的木炭培养物收集稳定转化的自由生活的成人（Lok，2007）使用Gentra Puregene Tissue Kit从约500只自由生活的成虫中提取基因组DNA（gDNA）。寄生虫不需要均质化。将分离的蠕虫以14,000×g离心，然后在步骤2中代替"研磨的组织"，然后用Gentra Puregene Tissue Kit的制造商方案的步骤2b，使用推荐用于组织样品的试剂体积 5-10 mg。将提取的gDNA重悬于50μlTE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0）中，得到约25ng /μl。
用BstYI，BamHI和Bgl II消化基因组DNA（〜100ng）2小时，每个反应的总体积为15μl（图1A）。按照制造商对每种限制酶的反应条件和失活步骤的说明。
在100μl的总反应体积中加入5μl100μMSPLINK-BOT寡核苷酸，5μl100μMSPLINK-GATC-TOP寡核苷酸和10×NEB缓冲液2。加热至95℃3分钟，然后在台上冷却至室温，以退火分散体寡核苷酸。使用T4连接酶在16℃下在总体积30μl中用G连接酶将消化的gDNA（具有GATC粘性末端）与退火的分离寡核苷酸一起温育8小时（图1B）。
在将基因组DNA限制性片段连接到splinkerette寡核苷酸后进行两轮spPCR。
1. 对于第一轮spPCR，组合引物SPLINK＃1，其靶向连接的splinkerette寡核苷酸，用引物3'SPLNK-PB＃1 或引物5'SPLNK-PB＃1。 3'SPLNK-PB＃1和5'SPLNK-PB＃1靶向3'和3' 5'末端。进行用Phusion聚合酶和5-20ng的扩增 splinkerette连接的基因组DNA作为模板。热循环条件是：
  1. 98℃1分钟
  2. 98℃20秒
  3. 55℃15秒
  4. 72℃2分钟
  5. 29个循环从ii到iv
  6. 最后在72℃延伸10分钟。
2. 第二轮spPCR是使用与引物3'SPLNK-PB＃2或引物5'SPLNK-PB＃2配对的引物SPLNK＃2和来自第一轮spPCR的spPCR产物的1:20稀释液进行的巢式PCR作为模板。使用与第一轮spPCR所指定的相同的热循环条件，用Phusion高保真DNA聚合酶进行第二轮扩增。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析所有PCR产物。
3. 孵育第二轮spPCR的产品与1微升虾碱磷酸酶（1U/ml）和1μl外切核酸酶I（20,000U/ml）在37℃下2 h，然后在80℃下15分钟（图1C）。
4. 使用引物3'SPLNK-PB-SEQ ...直接序列处理的PCR产物和5'SPLNK-PB-SEQ，其靶向转基因的3'和5'端序列。识别整合的染色体位置基于产生的序列和基因组中的匹配片段数据库（图1D，1E）。

致谢

该协议详述了最初在Shao等人（2012）中公开的方法。这项工作由来自美国国立卫生研究院的授权号AI050668资助。

参考文献

Lok，J.B。 Strongyloides stercoralis ：用于寄生线虫生物学的翻译研究的模型（2007年2月17日）， WormBook C. elegans 研究社群，WormBook，doi/10.1895/wormbook.1.134.1， http： //www.wormbook.org。
Potter，C.J。和Luo，L。（2010）。 Splinkerette PCR用于在果蝇中映射转座元件。 < em> PLoS One 5（4）： e10168。
Shao，H.，Li，X.，Nolan，T.J.，Massey，H.C.，Jr.，Pearce，E.J.and Lok，J.B。（2012）。转座子介导的转基因在寄生线虫中的染色体整合 Strongyloides ratti 和建立稳定的转基因株系。 PLoS Pathog 8（8）：e1002871。
Viney，M.E.and Lok，J.B。 Strongyloides （2007年5月23日）， WormBook C。 elegans Research Community，WormBook，doi/10.1895/wormbook.1.141.1， http：//www.wormbook。 org 。