材料和试剂

马铃薯植物（ Solanum tuberosum cv。Désirée）
马铃薯胞囊线虫（ G rostochiensis ）囊肿
叠氮化钠（RICCA Chemical，目录号：7144-16）
氯化汞（RICCA Chemical，目录号：4650-16）
无菌蒸馏水
庆大霉素（Fisher Scientific，目录号：61398-0010）
制霉菌素（Sigma-Aldrich，目录号：N-3503）
琼脂糖（Fisher Scientific，目录号：BP160-100）
Timentin（ Phyto Technology Laboratories ^®，目录号：T869）
Micropore胶带（Fisher Scientific，目录号：19-027-761）
灭菌溶液（0.004％氯化汞/0.004％叠氮化钠）
Hoagland's溶液（Sigma-Aldrich，目录号：H2395）
Amberlite XAD-4树脂（Fisher Scientific，目录号：AC20223）
MS盐（Caisson Laboratories，目录号：MSP01-50LT）
肌醇（Fisher Scientific，目录号：AC122261000）
盐酸硫胺素（Sigma-Aldrich，目录号：T1270）
Gelrite（Fisher Scientific，目录号：CAS 71010-52-1）
马铃薯根分泌物（PRD）（参见食谱）
传播介质（参见配方）
0.1％琼脂糖（参见配方）

设备

筛号60（250μm），200号（75μm）和500号（25μm）（Endecotts，目录号：683927,681837,691131）
无菌线虫卵孵化室（不锈钢金属锅盖和收集盘可购自Vollrath Products，尺寸为6英寸;如图3所示，在中心区域具有金属丝筛网的金属筛网盖是定制的） >
无菌6孔板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：657185）
搅拌板
无菌镊子和手术刀
生长孵化器
30-mesh（小部件，目录号：7050-1220-000-12）
组织培养生物安全柜
离心机
孵育摇床（New Brunswick Scientific，型号：C24KC）
tuberosum生长室（我们使用几种类型的生长室，如来自Percival的I-66LLVL）
橡胶塞（尺寸1号）（Fisher Scientific，目录号：14-130℃）
烧杯
铝箔
解剖显微镜

程序

植物生长
1. 在无菌环境中，切割节段茎段（约1cm长）（图1），并将茎片牢固地推入每孔含有6至7ml的传代培养基的6孔板中，其中含有特美汀（100μg/ml），使茎的顶部暴露（图2）
2. 标签板并用微孔胶带密封
3. 在生长培养箱中，在24℃，16小时/8小时光照/黑暗循环下培养两周，直到根出现几天。
  
  图1.在传播介质中生长的马铃薯苗。节段如下所示。
  
  图2.具有嵌入传播介质中的马铃薯节段的6孔板
线虫卵孵化和灭菌（所有以下步骤在室温下进行）
1. 在接种前一周，在室温下在用铝箔松散地覆盖的小（20-30ml）烧杯中浸泡线虫囊肿，并每天检查以确保囊肿在7天水合期间完全浸泡在水中。
2. 使用以下方法粉碎囊肿：
  1. 将筛子放在顶部有60号筛，中间有200号筛，底部有500号筛。
  2. 将囊肿从烧杯中倒入筛子，用水冲洗烧杯以收集剩余的囊肿。
  3. 用橡胶塞，使用圆周运动通过60号筛子研磨囊肿，经常用自来水洗涤以保持囊肿离开两侧。研磨，直到没有更多的囊肿片将通过屏幕
  4. 用水彻底冲洗60号筛。
  5. 取出顶部的筛子并丢弃内容物。用水彻底冲洗200号筛并取出。线虫卵收集在500号筛上
  6. 使用水瓶从500号筛子冲洗鸡蛋到一个干净的250毫升玻璃烧杯
3. 加入叠氮化钠溶液（注意：TOXIC！戴丁腈手套）到含有线虫卵的烧杯中，并用水补足至100 ml。鸡蛋悬浮液的最终浓度应为0.02％叠氮化钠
4. 在搅拌板上搅拌鸡蛋悬浮液20分钟。
5. 将鸡蛋悬浮液倒在先前使用的500号筛上，用恒定流量的自来水冲洗鸡蛋约2分钟，以除去所有痕量的叠氮化钠。
6. 设置孵化室（图3）。将大型网筛盘放在固体盘上，并在筛盘上放置30-μm网孔。使用含有庆大霉素（1.5mg/ml）和制霉菌素（0.1mg/ml）抗生素的PRD小心地将来自500号筛的线虫卵冲洗到30-μm网上。确保添加足够的PRD与抗生素进入孵化室覆盖30-μm网格。盖上一个倒置的固体盘，放在托盘中。所有的平底锅和30-μm筛网在使用前必须高压灭菌
  
  图3.线虫卵孵化室组装
7. 让鸡蛋在室温下孵化3-4天，确保有足够的PRD（使用适当的抗生素）
8. 将孵出的幼鱼（J2）（图4）倒入小玻璃烧杯中数小时，然后使用，让蠕虫在烧杯底部沉降。
  
  图4.阴影线虫幼稚（J2）
9. 检查解剖范围内的J2悬浮液是否有严重的细菌或真菌污染的迹象。如果严重污染，不要用于接种工作
10. 使用玻璃吸管尽可能多地取出PRD（不干扰底部沉降的J2），并在1.5ml低保留离心管中在13,400×g下旋转J2s 2分钟。将J2s重悬于1ml无菌水中
11. 通过进行1:10稀释和计数J2s在5个10-μl滴中计数J2s。根据10μl液滴中J2的平均数计算1ml中J2的总数，并在13,400×g 下旋转2分钟所需的J2s量（旋转更多J2s比感染所需的，因为一些线虫在灭菌后会死亡）。继续灭菌。
12. 灭菌
  1. 向含有J2s的每个管中加入1ml稀释的灭菌溶液（0.004％氯化汞/0.004%叠氮化钠;注意：TOXIC！戴丁腈手套）。关闭管并在摇动摇床上孵育10分钟
  2. 旋转J2s在13,400 x g 2分钟。移除灭菌溶液，并丢弃在特殊的废物容器中（含汞溶液不得在水槽中丢弃）。
  3. 用1ml无菌蒸馏水洗涤J2，在摇动摇床上孵育5分钟，然后离心除去水。重复洗涤步骤三次以上。
  4. 重悬在J2毫升无菌蒸馏水中，取出10微升的悬浮液计数。计算获得所需的感染J2数所需的卷。
13. 离心机旋转下来J2s，尽可能多地除去水。加入计算体积的0.1％琼脂糖以获得所需的J2s感染密度（建议使用每μl1 - 3 J2）。
感染。 tuberosum with potato cyst nematode G。 rostochiensis
1. 使用无菌技术切割6孔板中的马铃薯苗的顶部
2. 取决于实验，用100-200个线虫J2接种每个马铃薯苗。吸取所需体积的J2琼脂糖悬浮液，并将吸头尖插入培养基，并释放线虫悬液周围的根尖（执行接种后半小时后J2s悬浮在0.1％琼脂糖，因为长悬浮在这种琼脂糖溶液中降低线虫感染性）
3. 用微孔带和返回板在生长室中密封（24℃，黑暗条件）
4. 监控 G的开发。 rostochiensis 在马铃薯小根根每周在接下来的四到五个星期。两周的感染后，J3期的线虫应该是可见的
5. 计数线虫女性感染后四至五周
  1. 取出每个苗（包括培养基）并放在培养皿（直径100mm）的盖子上。切除苗的顶部，只是保持根，在板上加几滴水，盖上另一半的培养皿在上面。轻轻按下顶部培养皿，直到培养基和根部在底部培养皿上完全扩展（图5）。
  2. 在解剖显微镜下计数此板上的女性
    
    图5.在马铃薯根上形成的线虫雌性（一些由于处理而从根分离）

食谱

马铃薯根分泌物（PRD）
将土豆（具有芽苗的块茎）种植在填充有珍珠岩并在底部装配管的4L倒置的琥珀色玻璃瓶中，在温室内生长。植物用1/2强度的Hoagland溶液受精，并在整个生长季节保持湿润。以每周的间隔，从种植后三至十周开始，向盆中装入蒸馏水，静置1小时，然后排出并收集含有根扩散物的水。将该物质通过Amberlite XAD-4树脂的柱床，用500ml水冲洗，然后用500ml甲醇洗脱。将甲醇洗脱液转子蒸发至最小体积（通常为2ml），转移至小瓶中，用液氮冷冻，并置于-80℃冰箱中。用无菌蒸馏水稀释1：800，用于线虫卵孵化
繁殖培养基（1 L）
4.3克MS盐
0.17g NaH 2 PO 4 subO 2。 H O 0.10克肌醇
0.4mg硫胺素HCl 30克蔗糖 2.5克gelrite
用KOH和高压釜将pH调节至6.0
0.1％琼脂糖
0.1g琼脂糖在100ml蒸馏水中的溶液高压灭菌并在室温下贮存

致谢

这项工作得到了美国农业部的资助。

参考文献

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Chronis，D.，Chen，S.，Lu，S.，Hewezi，T.，Carpenter，S.C.，Loria，R.，Baum，T.J.and Wang，X.（2013）。泛素羧基延伸蛋白从植物寄生线虫分泌的植物寄生线虫（Globodera rostochiensis）在植物中被切割以促进植物寄生。植物杂志74（2）：185-196。
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Sijmons，P.C.，Grundler，F.M.，Mende，N.，Burrows，P.R.and Wyss，U.（1991）。拟南芥作为新模型植物寄生线虫的宿主。植物J 1（2）：245-254。