材料和试剂

组织培养小植株的马铃薯（ S.tuberosum cv。Désirée）
70％乙醇
漂白剂（6％次氯酸钠）
吐温20
Acetosyringone（Fisher Scientific，目录号：AC11554）
Timentin（ Phyto Technology Laboratories ^®，目录号：T869）
选择性抗生素
甘露醇（Fisher Scientific，目录号：M120）
甘氨酸
烟酸（Sigma-Aldrich，目录号：N0761）
盐酸吡哆醇（Sigma-Aldrich，目录号：P6280）
盐酸硫胺素（Sigma-Aldrich，目录号：T1270）
叶酸（Fisher Scientific，目录号：BP2519）
生物素（Fisher Scientific，目录号：BP232）
MS盐（Caisson Laboratories，目录号：MSP01-50LT）
肌醇（Fisher Scientific，目录号：AC122261000）
蔗糖
6-苄氨基嘌呤（BAP）（Sigma-Aldrich，目录号：B3408）
（NAA）（Sigma-Aldrich，目录号：N0640）
（IAA）（Sigma-Aldrich，目录号：I2886）
反 - 玉米素 - 核糖核苷（Sigma-Aldrich，目录号：Z0876）
YM介质（参见配方）
MSVI维生素（参见食谱）
JHMS维生素（见配方）
3R维生素（见配方）
CIM介质（参见配方）
具有选择剂的3C5ZR板（参见配方）
传播介质（参见配方）
TPS缓冲区（参见配方）

设备

无菌洋红色盒（高压灭菌）
无菌培养皿（Fisher scientific，目录号：FB0875712）
无菌镊子和手术刀（使用本生灯进行热处理消毒）
具有盖的灭菌玻璃管（通过高压灭菌灭菌）（管，Fisher Scientific，目录号：14-961-34;帽，Fisher Scientific，目录号：14-957-91D）
无菌接种环（Fisher Scientific，目录号：22-363-604）
组织研磨机
玻璃培养管（高压灭菌）
3M Micropore带（Fisher Scientific，目录号：1530-0和1530-1）
农杆菌甘油原液
50ml锥形离心管
组织培养生物安全柜
孵育摇床（New Brunswick Scientific，型号：C24KC）
离心机
tuberosum生长室（我们使用几种类型的生长室，如来自Percival的I-66LLVL）
热块或水浴
PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：C1000 touch）

程序

马铃薯组织培养小植株的生成和繁殖（在无菌条件下进行）
1. 从植物的马铃薯块茎或茎段（含至少一个节间）消化芽（至少2.5至4cm长），并对这些植物表面进行表面灭菌：
  1. 用70％乙醇洗涤1-2分钟
  2. 使用无菌镊子将植物片段转移到含有微量Tween 20（1μl/ml）的10％漂白剂中并浸泡10-12分钟。
  3. 将植物块转移到70％乙醇，冲洗1-2分钟
  4. 用大量无菌蒸馏水清洗，以除去任何痕量的乙醇
2. 用无菌手术刀修剪灭菌的植物碎片，以去除损伤的细胞层，并在24小时/16小时/8小时光照/黑暗循环下，在玻璃管中的每个植物片段在繁殖培养基上培养。植物来源于灭菌的植物碎片通常建立大约四至六周。
3. 从小植物切下约1厘米长的节段茎段（图1），并牢牢地推入含有繁殖培养基的洋红盒或玻璃管，使茎的顶部暴露。每个盒子放置6个片段或每个玻璃管放置一个片段，并用微孔胶带密封盒盖或管盖。大约二十四个小植物适于转化一个构建体
4. 在24℃，16小时/8小时光照/黑暗循环下，在生长培养箱中培养4至6周。
  
  图1.在传播介质中生长的马铃薯苗。节点和节间部分如图所示。
土壤杆菌制剂
1. 在感染前4天，在具有适当抗生素的YM平板上划线携带所需构建体（转基因）的根癌土壤杆菌LBA4404。将板在28℃下孵育三天。
2. 在感染前一天，用农杆菌菌落接种10ml YM，并在恒温摇床上在28℃下培养直至OD 00达到0.7（通常需要过夜培养）。 br />
3. 在接种当天，在室温下以9000×g离心土壤杆菌培养物15分钟，并将沉淀重悬于10ml CIM液体培养基中。
4. 向土壤杆菌悬浮液中加入50μl的0.074M乙酰丁香酮（乙酰丁香酮的最终浓度为0.37mM）。在一小时内使用，因为单元格将开始聚合
马铃薯转化（在无菌条件下进行）
1. 在感染的当天，将4至6周小植株的节间茎段（图1）切成约1cm的块并转移至CIM平板。
2. 孵育外植体与10毫升农杆菌接种20分钟，偶尔涡旋板。我们通常每个结构使用100个茎片。
3. 使用无菌镊子将细菌培养物的茎片转移到新的CIM培养基平板上。标签板，用微孔胶带密封，并将它们放回到24℃的孵化器在黑暗中
4. 三天后，将茎片转移到具有适当抗生素和500μg/ml特美汀的3C5ZR培养基平板上。特美汀用于抑制em的生长。 tumefaciens LBA4404。
5. 将板置于生长培养箱中（24℃，16小时/8小时光照/黑暗循环），并将茎片段每7至10天转移到新鲜的3C5ZR培养基平板上，直到小植株出现（图2）。
6. 当小植株至少半厘米长时，将它们从外植体切下并转移到含有10ml具有100μg/ml适当抗生素和特美汀的繁殖培养基的培养管中。可以使用无菌接种环将小植株的基部轻轻推入培养基中。用微孔胶带标记并密封试管。
7. 种植植物3 - 4周，直到根成熟。丢弃在一个月内不生根的植物，因为它们不是转基因的
8. 根据需要切割和再繁殖转基因植物
  
  图2.在3C5ZR培养基上培养的马铃薯节间切片。小植株（指示的）从感染的节或茎节中出现。
PCR筛选
1. 将约一半至一平方厘米的叶组织切成1.5ml离心管
2. 每管加入200μlTPS
3. 用组织研磨机研磨TPS中的组织以获得均匀的浆料
4. 在75°C孵育样品20分钟。
5. 以13,400×g离心10分钟。
6. 将上清液转移到新管中，并向每个管中加入等体积的异丙醇。通过倒置混合管。
7. 以13,400×g离心10分钟。 DNA沉淀在这一点应该是可见的
8. 除去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀。以13,400×g离心5分钟。
9. 去除上清，风干沉淀，并重悬在30μl无菌蒸馏水或含RNaseA（100μg/ml）的TE中。
10. 使用1μlDNA作为模板，用于转化体的PCR筛选
11. 典型PCR程序：
  第一步：95℃3分钟
  第二步：94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟×30个循环
  第三步：72℃5分钟

食谱

制备以下培养基并在室温下储存。含有抗生素的灌注的培养基平板可以在4℃下储存长达一个月。可以制备维生素，等分并保存在-20℃。

YM中（1 L）
0.4g酵母提取物
10克甘露醇*
0.1克NaCl
0.2g MgSO 4。7H 2 O 2 0.5g KH 2 PO 4 sub/
10g琼脂（用于板）
高压灭菌器
*分别制作和高压釜，使10 g/100 ml，并使用100 ml/L
MSVI维生素
2mg/ml甘氨酸 0.5mg/ml烟酸
0.5mg/ml盐酸吡哆醇
0.4mg/ml硫胺素HCl
JHMS维生素
0.4mg/ml叶酸
50μg/ml生物素
3R维生素
1mg/ml硫胺素HCl
0.5mg/ml烟酸
0.5mg/ml盐酸吡哆醇
CIM培养基（1L）
4.3克MS盐
1 ml MSVI维生素
1 ml JHMS维生素
0.1g肌醇
30克蔗糖 1mg 6-苄基氨基嘌呤（BAP）
2mg 1-萘 - 乙酸（NAA）
10g琼脂（用于平板）
用KOH和高压釜将pH调节至5.6
3C5ZR培养基（1L） 4.3克MS盐
1 ml 3R维生素
0.1g肌醇
30克蔗糖 10g琼脂（用于平板）
用KOH和高压釜
调节pH至5.9 0.5mg 3-吲哚乙酸（IAA）*
3mg反式玉米素 - 核糖核苷*
500毫克特美汀*
选择代理**
*灭菌后添加
**使用适当的选择剂和浓度的结构
繁殖培养基（1 L）
4.3克MS盐
0.17g NaH 2 PO 4 subO 2。 H O 0.1g肌醇
0.4mg硫胺素HCl 30克蔗糖 2.5g gelrite或10g琼脂用KOH和高压釜将pH调节至6.0
TPS缓冲区
100mM Tris HCl（pH8.0） 100mM EDTA（pH8.0） 1 M KCl

致谢

这项工作得到了美国农业部的资助。

参考文献

Cheng，Z.M.，Schnurr，J.A。和Kapaun J.A。（1998）。 Timentin作为遗传转化中根癌土壤杆菌的替代抗生素 >。 Plant Cell Rep 17：646-649
Chronis，D.，Chen，S.，Lu，S.，Hewezi，T.，Carpenter，S.C.，Loria，R.，Baum，T.J.and Wang，X.（2013）。从植物寄生线虫分泌的泛素羧基延伸蛋白在植物中裂解以促进植物寄生。植物J 74（2）：185-196。
Jung，C.S.，Griffiths，H.M.，De Jong，D.M.，Cheng，S.，Bodis，M。和De Jong，W.S.（2005）。马铃薯 P 位点编码类黄酮3'，5'-羟化酶。 Theor Appl Genet 110（2）：269-275。