材料和试剂

淋巴结单核细胞（LMNC）
Benzonse Nuclease（EMD Millipore，目录号：70664）
LIVE/DEAD ^® Fixable Aqua死细胞染色试剂盒（Life Technologies，目录号：L34957）
葡萄球菌肠毒素B（Toxin Technology Inc，目录号：BT202）
RPMI 1640 Medium 1x用L-谷氨酰胺（Fischer Scientific，目录号：10-040-CV）
100x青霉素 - 链霉素溶液（5000单位）（Life Technologies，目录号：15070063）
胎牛血清（FBS）（接入细胞培养）
RPMI 1640 Medium 1x与L-谷氨酰胺且不含酚红（Gibco ，Life Technologies，目录号：11835-030）
HEPES溶液（1M）（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
抗体：
1. 抗CD3（克隆：HIT3a）（BioLegend）
2. 抗CD4（克隆：RPA-T4）（BioLegend）
3. 抗CD45RA（克隆：IM2711U）（Beckman Coulter）
4. 抗CXCR5（克隆：RF8B2）（BD Biosciences）
5. 抗CD19（克隆：HIB19）（BioLegend）
6. 抗IgD（克隆：IA6-2）（BD Biosciences）
7. 抗CD38（克隆：HIT2）（BioLegend）
完成媒体（见配方）
排序缓冲区（请参阅配方）

设备

离心机（Thermo Fisher Scientific的Sorvall TM Suppress TM XTR）
15 ml Falcon管
BD FACSAria II细胞分选仪（BD Biosciences）
37℃5％CO 2培养箱
96孔无菌V-底板（Thermo Fisher Scientific，目录号：249935）
具有细胞 - 滤器盖的5mL聚苯乙烯圆底管（BD Falcon TM，，目录号：352235）

程序

解冻淋巴结单核细胞（LMNCs），并洗涤一次，以去除从冷冻介质携带的所有痕量的DMSO。关于淋巴结样品和加工方案的信息，参见参考文献1（Cubas等人，2013）。
计数细胞，并在15ml Falcon管中的完全培养基中以1×10 7个细胞/ml重悬。
通过加入25U/ml的Benzonase核酸酶以在所有DNA/RNA中降解所有的DNA/RNA并改进所述DNA/RNA，在37℃，5％CO 2的培养箱中处理细胞30分钟。细胞的活力。
在冰冷的分选缓冲液（含有HEPES）中以1,500rpm将细胞沉淀5分钟，并以5×10 7个细胞/ml的浓度重悬于分选缓冲液中。
按照制造商的说明书用活力染料如LIVE/DEAD可固定水族死细胞试剂盒（Vivid）染色细胞。
随后，用以下抗体染色细胞：抗CD3（克隆：HIT3a），抗CD4（克隆：RPA-T4），抗CD45RA（克隆：IM2711U），抗CXCR5（克隆：RF8B2）至门在Tfh细胞上。此外，基于您想要包括在共培养测定中的B细胞群体包括B细胞标记物。对于生发中心B细胞，可以使用以下通用标记：抗-CD19（克隆：HIB19），抗-IgD（克隆：IA6-2），抗-CD38（克隆：HIT2）。
在冰上染色细胞15分钟。
将细胞重悬在分选缓冲液中，并在1,500 rpm下旋转5分钟。
除去上清液并以3×10 7个细胞/ml重悬以进行分选。通过使细胞通过具有细胞 - 过滤器帽的5ml聚苯乙烯圆底管来过滤细胞。
继续细胞分选。门Tfh细胞和生发中心（GC）B细胞在排除双联体和死细胞后：CD3 + CD45RA -/- > CXCR5 ^{++（图1）和CD3 - - - CD19 -/- CD38 -/- > IgD - sup/- （图2 ）分别。

图1.用于分选Tfh细胞的门控策略。 Tfh细胞被门控为CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD45RA ^- CXCR5 ⁺⁺细胞排除双联体和死细胞后

图2.用于分选GC B细胞的门控策略。GC B细胞被门控为CD3 ^- CD19 ⁺ IgD ^- CD38 ⁺细胞。描述了CD38阳性IgD点图中的不同B细胞群体。}
一旦细胞分选，重悬在完全培养基中并在1,500rpm离心5分钟。小心地取出上清液，并确保所有的介质被取出。重悬细胞在250微升或500微升的完全培养基（取决于分选细胞的数量），并计数细胞。强烈建议对分选的不同细胞群进行分选后检查，以确认细胞纯度。
在完全培养基中重悬细胞（分选的Tfh细胞和GC B细胞），并以1,200rpm再次旋转5分钟。小心地和彻底地除去上清液并且在适当量的完全培养基中重悬以在50μl中具有1×10 5个细胞（可以决定在其他浓度下重悬，但是共培养物将具有最终体积100μl，所以你不想有一个体积大于50微升1×10 ⁵细胞，因为你正在培养Tfh细胞和GC B细胞）。
将50μl（1×10 5个细胞）从分选的Tfh细胞和GC B细胞转移到96-孔V-底板（1:1比例）的孔中。
向每个孔中加入100ng/ml的葡萄球菌肠毒素B（SEB），以模拟T细胞和B细胞之间的抗原特异性相互作用。小心轻拍板以混合并在900rpm离心1分钟。
基于测量的读数，在37℃，5％CO 2下孵育细胞7天或不同天数。建议在稍后的时间点测试细胞的活力和读数测量。测量共培养上清液中IgG的总水平可以用作Tfh介导的B细胞帮助的量度。阴性对照可以包括将GC B细胞与不提供B细胞帮助的幼稚CD45RA +细胞或CD45RA -/- CXCR5 - 细胞孵育。通过流式细胞术的细胞表征也可以用于在期望的时间点测量B细胞活化和活细胞的绝对数量。

食谱

填写媒体
RPMI 1640（含L-谷氨酰胺）
10％FBS
1x Pen/Strep
排序缓冲区
RPMI 1640（含L-谷氨酰胺+无酚红） 2％FBS
1x Pen/Strep
25 mM HEPES

致谢

该协议最早在Cubas等人（2013）中使用。

参考文献

Cubas，RA，Mudd，JC，Savoye，AL，Perreau，M.，van Grevenynghe，J.，Metcalf，T.，Connick，E.，Meditz，A.，Freeman，GJ，Abesada-Terk， Jacobson，JM，Brooks，AD，Crotty，S.，Estes，JD，Pantaleo，G.，Lederman，MM和Haddad，EK（2013）。不充分的T滤泡细胞帮助损害HIV感染期间的B细胞免疫力。 Med 19（4）：494-499