材料和试剂

甘油（Carl Roth，目录号：7530.4）
Tris（J.T.Baker ，目录号：1414）
NaCl（AppliChem GmbH，目录号：A3597.5000）
MgCl 2（Merck KGaA，目录号：1.05833.1000）
蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：04693159001）
DNAse I（Roche Diagnostics，目录号：10104159001）
溶菌酶（Roche Diagnostics，目录号：10153516103）
酪蛋白水解物（Oxoid Limited，目录号：LP0041）
缓冲区A（参见配方）
酪蛋白水解物（CH-培养基）（参见配方）
解决方案G（参见配方）

设备

玻璃珠（直径0.2-0.3mm）（Sigma-Aldrich，目录号：G1277）
法式压力匀浆器（Glen Mills，French press G-M ）
超离心机（Beckman Coulter，型号：optima ^TM XPN-100）
Ti-70转子（Beckman Coulter）
FastPrep组织匀浆器（MP Biomedicals，型号：116004500）
冷冻离心机（例如：Beckman Coulter，型号：Avanti-J25）
Acrodisc 注射器过滤器（孔径为0.2μm）（Pall，目录号：4652）

程序

接种 B。（LB），Spizizen基本培养基（SMM）中，在适当的培养基[例如CH]中培养至OD 600为0.1。这里我们使用CH培养基中的50ml培养物]
将细胞生长至相应的OD 600（这里我们使用OD 600为4，在37℃下生长的细胞;在具有挡板的250ml烧瓶中以150rpm培养）。< br/>
通过离心收集细胞（10,000×g; 15分钟; 4℃）
弃去上清液，并在4℃下在预冷的缓冲液A中的1/5体积的原始培养物中重悬细胞
再次离心（10,000×g; 15分钟; 4℃）
弃去上清液，并在补充有蛋白酶抑制剂和DNA酶I的4℃下在缓冲液A中的5-8x体积的细胞沉淀中重悬细胞。使用制造商指定的浓度。
中断单元格
注意：如果细胞破碎是关键的，细胞悬浮液可以与溶菌酶（50μg/ml）在冰上温育30-120分钟，然后细胞破碎，显微镜检查。
1. 小细胞体积（反应管中1ml）可以在FastPrep组织匀浆器中以6.5m/s用直径0.2-0.3mm玻璃珠破碎30秒，并在运行之间在冰上冷却5分钟（最小5 运行）。
2. 更大的细胞体积可以在French Press匀浆器中在125MPa和3-5次通过下破碎。将样品在冰上冷却5分钟。请注意，只有使用法语Press系统才会生成内向外的囊泡。
通过离心（12,000×g ; 15分钟; 4℃）除去细胞碎片
收集上清液（细胞裂解物），并以≥200,000×g离心; 4℃和60-90分钟（例如在Beckman-Coulter Ti-70转子中以45,000rpm）。
注意：离心时间越长，蛋白质浓度越高，膜的分离越好。
上清液表示细胞质部分; 小球包含 B。枯草芽孢杆菌膜（脂质，跨膜蛋白和膜相关蛋白）。
注意：将沉淀重悬于适当的缓冲液中，例如，缓冲区A。

食谱

缓冲区A
50mM Tris·HCl（pH7.5） 150mM NaCl 5mM MgCl 2/
10％甘油（v/v）
CH-medium
50ml溶液G（见下文）
0.05ml 0.1M CaCl 2·h/v 0.02ml 1M MgSO 4。7H 2 O 2 0.1ml 0.0475M MnSO 4
0.5ml 2mg xml 色氨酸注射器过滤器过滤灭菌;使用Acrodisc 新鲜准备
解决方案G
25.0g酪蛋白水解产物 9.2g L-谷氨酸 3.125g L-丙氨酸 3.48g L-天冬酰胺 3.4g KH 2 PO 4 sub/
1.34g NH 4 Cl
0.27g Na 2 SO 4。
0.24g NH 4 NO 3 sub。 2.45mg FeCl 3 。 6H 2 O ddH 2 O 2.35L，并用10N NaOH调节pH至7.0 高压灭菌; 储存在4℃下

致谢

该协议改编自Bach和Bramkamp（2013）。

参考文献

Bach，J.N.和Bramkamp，M。（2013）。 Flotillins功能性组织细菌膜。 Mol Microbiol 88 （6）：1205-1217。