材料和试剂

小鼠脾细胞或ES衍生的造血细胞
DNA提取试剂盒：PerfectPure DNA Cultured Cell Kit（5 PRIME，目录号：2302000）
用KCl的10x PCR缓冲液（Life Technologies，Applied Biosystems ，目录号：4338856）
MgCl 2（Life Technologies，Applied Biosystems ，目录号：4338856）
Taq DNA聚合酶（Life Technologies，Applied Biosystems ，目录号：4338856）
dNTP（Life Technologies，Applied Biosystems ，目录号：4338856）
引物（FASMAC）
引物的序列如下：
一个。 D H（5'）：GGAATTCG（AorC）TTTTTGT（CorG）AAGGGATCTACTACTGTG b。 Mu0（5'）：CCGCATGCCAAGGCTAGCCTGAAAGATTACC
c。 J3（3'）：GTCTAGATTCTCACAAGAGTCCGATAGACCCTGG
琼脂糖（Ultra Technologies）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：16500-100）
溴化乙锭（和光纯药工业，目录号：315-90051）

设备

PCR热循环仪（Veriti Thermal Cycler）（Life Technologies，Applied Biosystems ）。
离心机（TOMY SEIKO，型号：MX-150）
电泳装置（ADVANCE，Mupid-exU）

程序

通过在75μl中裂解小鼠脾细胞（1-4×10 4个）或ES衍生的造血细胞（3-5×10 5个）来制备基因组DNA用于PCR 洗脱溶液。请参阅制造商协议（ http://www.5prime.com/media/3415/perfectpure dna culture cell manual_5prime_1064553_122010.pdf ）。
20μlPCR反应物含有5.5μl模板（82.5ng或更少），10mM Tris-HCl，50mM KCl，2.0mM MgCl 2，1μM引物（25mer），200μMdNTP和1μl U Taq DNA聚合酶
PCR程序
一个。 94℃-2分钟
b。 94°C - 1分钟
C。 60°C - 1分钟
d。 72℃ - 1.75分钟
e。重复步骤b-d，35x
F。 72°C - 10分钟
将每个PCR产物的一半在1％琼脂糖凝胶上电泳，并通过用溴化乙锭染色评价其量。
使用引物D H L（5'）检测到1033bp，716bp和333bp的扩增片段，其结果显示，使用引物D H ）和J3（3'）。使用引物Mu0（5'）和J3（3'），将种系等位基因检测为1,259bp的扩增片段。

结果

图1.进行种系（GL）或D H H -J H重排的lgh链（DJ）基因的DNA PCR测定与小鼠脾细胞的比较。使用引物D H（5'）和J3（3'）的PCR实验可以检测三种类型的D H H H重排（J1，J2和J3）（Schlissel等人，1991）。所有三个条带都具有成功的D H H -J H重排。然而，当模板DNA的量非常小时，在基于溴化乙锭的DNA条带可视化中有时未检测到J1条带。将大小标记物装载在左泳道中。

致谢

该方案改编自Schlissel等人先前发表的论文（1991）。方案中所示的代表性数据来自Satoh et al。（2013）。

参考文献

Satoh，Y.，Yokota，T.，Sudo，T.，Kondo，M.，Lai，A.，Kincade，PW，Kouro，T.，Iida，R.，Kokame，K.，Miyata，T.，Habuchi ，Y.，Matsui，K.，Tanaka，H.，Matsumura，I.，Oritani，K.，Kohwi-Shigematsu，T.and Kanakura，Y。 Satb1蛋白指导造血干细胞向淋巴谱系分化。免疫 38（6）：1105-1115。
Schlissel，M.S.，Corcoran，L.M。和Baltimore，D。（1991）。病毒转化的前B细胞显示有序活化，但不会失活免疫球蛋白基因重排和转录。 J Exp Med 173（3）：711-720。