材料和试剂

小鼠肝脏
¹⁴ C标记的氨基酸（PerkinElmer）（选择您感兴趣的氨基酸）
3N甲醇HCl（Sigma-Aldrich，目录号：33051）
无水甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415）
蔗糖
HEPES
MOPS
Na 2 EDTA
KCl
MgCl 2
ATP-Mg
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
闪烁鸡尾酒（Research Products International，目录号：111175）
蛋白质测定试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0112）
均质缓冲液（HB）（参见配方）
高蔗糖缓冲液（见配方）
摄取缓冲区（请参阅配方）
流出缓冲区（参见配方）

设备

氮气罐（带调节器和连接管）
25毫升玻璃锥形瓶
1.5 ml和15 ml试管
30 G针
Dounce匀浆器
具有温度控制的高速离心机（最高25,000 x g）
玻璃纤维过滤器（GF/F级）（Whatman，目录号：1825-025）
真空过滤歧管（EMD Millipore，型号：1225）
液体闪烁计数器（Beckman Coulter，型号：LS6500）
用于使用放射性物质的个人防护设备

程序

注意：此协议涉及 ¹⁴ C标记的氨基酸。放射性同位素的使用和必要的安全预防措施应遵循制度规定。

氨基酸甲酯的制备
1. 将12.5μCi14 C标记的氨基酸转移到25ml玻璃锥形瓶中，并在氮气流下干燥。
  注意：干燥时间取决于氮气流的速度，约为10分钟。
2. 加入3ml 3N甲醇HCl到烧瓶中，并在室温下孵育24小时。这将将氨基酸转化为氨基酸甲酯。
  注意：用石蜡膜密封烧瓶的开口以防止甲醇HCl蒸发。转化效率可以用色谱法和高压电泳测定（Reeves，1979; Steinherz等，1982）。
3. 在氮气流下干燥所得的氨基酸甲酯。加入1ml无水甲醇溶解沉淀，并在氮气流下再次干燥注意：干燥时间取决于氮气流的速度。
4. 加入500μl无水甲醇溶解甲酯。通过在氮气流下蒸发使体积降至250μl。
5. 在流出测定之前，将适量转移到1.5ml管中。在氮气流下干燥。溶解于摄取缓冲液（终浓度0.005μCi/μl）注意：氨基酸甲酯在水溶液中不稳定。
粗溶酶体制备
1. 为了从小鼠肝制备粗制溶酶体制剂，遵循动物使用方案并在动物安乐死后切除肝脏。在冰冷的HB中冲洗注意：来自一只成年小鼠的肝脏足以进行一次测定。如果你需要测试多个氨基酸，计算一个小鼠肝脏可以得到的总蛋白浓度，并放大动物数量。
2. 将肝脏转移到Dounce匀浆器中，加入8ml冰冷的HB
3. 在冰上均质肝脏以破碎肝细胞（20次）
4. 在4℃下以1,000×g离心匀浆10分钟; 将上清液转移到新的离心管中并保持在冰上。
5. 在7ml HB（15次）中再次匀化沉淀; 在4℃下以1,000×g离心10分钟
6. 合并步骤B4-5的上清液; 在4℃下以20,000×g离心20分钟
7. 将沉淀重悬在10ml 250mM KCl（pH 7.4，1mM MOPS缓冲）中，并在4℃下以1,600×g离心10分钟。转移上清液到一个新鲜的管。此步骤使大多数线粒体沉淀。
8. 用2.5倍体积的高蔗糖缓冲液稀释上清液，并以25,000×g离心10分钟，以离心沉淀粗溶酶体。
9. 重悬在200μl吸收缓冲液中的粗溶酶体沉淀。以600×g离心2分钟。
10. 转移上清液到一个新的管，并保持在冰上。通过通过30 G针30次，重悬浮在100微升摄取缓冲液中的沉淀。将其与上清液合并。这将是粗溶酶体样品。
11. 使用一小部分粗溶酶体测量蛋白质测定的总蛋白浓度。调整浓度至2mg蛋白质当量的溶酶体/ml。保持其余的制剂在冰上，并进行外渗测定在12小时内。不建议更长的存储。
  注意：如果需要，可以使用例如OptiPrep密度梯度离心从上述制备中进一步纯化溶酶体（参见参考文献4和5）。
氨基酸流出测定
1. 对于每个反应，将50μl等分试样（含有100μg蛋白质等量的溶酶体）分配到1.5ml管中。
2. 为了引发氨基酸酯负载，向每个溶酶体等分试管中加入50μl氨基酸甲酯（0.25μCi，在吸收缓冲液中）。轻轻混匀通过吸移。在37℃孵育30分钟。
  注意：最佳加载时间和温度需要通过实验确定氨基酸和所用溶酶体的类型。
3. 在装载时间期间，组装Whatman过滤器（GF/F）到真空过滤歧管。用5ml PBS冲洗过滤器。调整过滤速度〜10 ml/min
4. 在加载结束时，通过将100μl加载反应转移到含有5ml预热（37℃）外排缓冲液的15ml管中，将加载反应稀释50倍;混合均匀并在37℃下孵育。这将开始流出。
5. 在每个流出时间点结束时，结合一个流出反应管（含5.1ml）与5ml冰冷PBS。在真空下立即通过Whatman过滤器过滤;用5ml冰冷洗涤两次 PBS。
6. 对于背景计数，分别孵育溶酶体和氨基酸甲酯（不加载）。孵育后立即混合和过滤。
7. 将滤膜在闪烁鸡尾酒中浸泡过夜。使用闪烁计数器计数。
8. 从同位素计数中减去背景。将背景扣除计数归一化为在流出时间点0获得的计数。在每个时间点的归一化计数表示保留在溶酶体中的氨基酸部分并反映氨基酸转运蛋白的活性。（参见图1的示例。）
  
  图1.使用小鼠粗制溶酶体和14 C-标记的精氨酸的代表性氨基酸流出结果。数据以平均值±SEM表示。

食谱

均质缓冲液（HB）
250mM蔗糖 1mM Na 2 EDTA 10mM HEPES（pH 7.0）
高蔗糖缓冲液
450mM蔗糖 0.5mM Na 2 EDTA 5mM HEPES（pH 7.2）
吸收缓冲区
250mM蔗糖 5mM MgCl 2/
20mM HEPES（pH 7.0）
流出缓冲区
250mM蔗糖 5mM MgCl 2/
20 mM HEPES
2mM ATP-Mg（pH7.0）

致谢

该方案改编自以前发表的论文（Cang等人，2013; Reeves，1979; Steinherz等人，1982; Graham等人， 1982）和来自Sigma-Alderich的溶酶体分离试剂盒的技术公报（参考文献5）。我们感谢Yandong Zhou博士和Dr. Youngjun Seo讨论和进行实验，并感谢Denia Ramirez-Montealegre博士就方案提供咨询。该协议的开发部分得到美国心脏协会，NIH和宾夕法尼亚大学研究基金会的资助。

参考文献

Cang，C.，Zhou，Y.，Navarro，B.，Seo，YJ，Aranda，K.，Shi，L.，Battaglia-Hsu，S.，Nissim，I.，Clapham，DE和Ren，D。 2013）。 mTOR调节溶酶体ATP敏感性两孔Na（+）通道以适应代谢状态。/a> 152（4）：778-790。
Graham，J.，Ford，T。和Rickwood，D。（1994）。在自发生成的碘克沙醇梯度中从小鼠肝脏制备亚细胞器官。 em> Anal Biochem 220（2）：367-373。
Reeves，J.P。（1979）。与氨基酸甲酯孵育的溶酶体积累氨基酸。 Biol Chem 254（18）：8914-8921。
Steinherz，R.，Tietze，F.，Raiford，D.，Gahl，W.A。和Schulman，J.D。（1982）。氨基酸从分离的正常和胱氨酸的人白细胞溶酶体流出的模式。 J Biol Chem 257（11）：6041-6049。
溶酶体分离技术公告 Kit（LYSISO1）。（Sigma-Aldrich）