材料和试剂

酵母菌株
注意：BG14用作光滑念珠菌亲本菌株。将hst1 Δ 和cta1 Δ em突变体分别用作阳性对照和阴性对照。/em>
来自牛肝的过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C9322）
Bradford试剂（Sigma-Aldrich，目录号：B6916）
牛血清白蛋白 - 级分V（Sigma-Aldrich，目录号：850-40℃）
氧化锆/二氧化硅珠（直径0.5mm）（Bio Spec Products，目录号：11079105z）
无菌水
冰块
在10ml磷酸盐缓冲液（Roche Diagnostics，目录号：05 892 970 001）中使用一片蛋白酶抑制剂cOmplete ULTRA Mini EASYpack
（Sigma-Aldrich，目录号：349887）。< br />
过氧化氢酶冻干粉（Sigma-Aldrich，目录号：C9322）
YPD肉汤（见配方）
无菌水
冰块
在10ml磷酸盐缓冲液（Roche Diagnostics，目录号：05 892 970 001）中使用一片蛋白酶抑制剂cOmplete ULTRA Mini EASYpack
（Sigma-Aldrich，目录号：349887）。< br />
过氧化氢酶冻干粉（Sigma-Aldrich，目录号：C9322）
YPD肉汤（见配方）
50 ml conical tubes
Corning 96 well clear flat bottom (Corning, catalog number: 3595)
Standard 10 mm light path quartz cuvette with PTFE cover
UV/Vis Spectrophotometer (Shimadzu, model: UV-1700, catalog number: 206-55401-92)
Microplate spectrophotometer system (Benchmark Plus Microplate reader) (Bio-Rad Laboratories, catalog number: 170-6931)
Centrifuge (Beckman Coulter, model: Allegra^® 25R, catalog number: 369464)
Microfuge
Stopwatch
Parafilm

Procedure

Preparation of total soluble extracts
1. Yeast strains are grown overnight in 5 ml of Yeast extract-Peptone-Dextrose broth or selective media at 30 °C.
2. 在50ml新鲜培养基中稀释过夜培养物，以便在7次重复后，酵母培养物在30℃达到OD 600 = 0.5。
3. 在2,600×g离心细胞5分钟。弃去上清液。离心机的温度不相关。
4. 用25 ml无菌水清洗细胞，弃去上清液
5. 重悬细胞在0.5毫升PB蛋白酶抑制剂和转移到微量离心管。将样品保存在冰上。
6. 向每个样品中加入50μl氧化锆/二氧化硅珠。
7. 通过以最大速度涡旋1分钟并在冰上放置另一分钟来破坏细胞。重复20次。
8. 在4℃下以25,000×g离心裂解物30分钟以除去细胞碎片和氧化锆/二氧化硅珠子
9. 将上清转移到干净的微量离心管中。在这一点上，裂解物准备用于总蛋白的定量和过氧化氢酶活性的测量。或者，样品可以储存在-20°C
Bradford测定蛋白质定量
1. 填充微孔板的250微升Bradford试剂的孔。
2. 使用新鲜BSA标准品（100,200,400,600,800ng /μl）制备吸光度相对于纳克蛋白质的标准曲线。使用PB作为溶剂。
3. 用无菌水稀释裂解液1:20或1:50。
4. 加载5μl的标准品和稀释裂解液到Bradford试剂。孵育室温5分钟。
5. 在微量板分光光度计中测量OD 595处的吸光度
6. 从标准曲线确定样品的蛋白质的量。考虑稀释因子。
过氧化氢酶活性测定
1. 设置分光光度计首先打开仪器，然后打开紫外灯。设置动力学程序，在240nm的波长下记录每30秒2分钟。
2. 使用3ml PB在3ml石英比色杯中作为空白校准分光光度计。
3. 用PB稀释裂解物样品1:50。
4. 在石英比色皿中，将1ml PB与1ml稀释的样品混合。为了开始测定，将1ml H 2 O 2 O 2溶液（H 2 O 2 O 2）加入到最终浓度为10mM）。初始吸光度必须在0.550和0.520之间。如果必要，添加H 2 O 2以增加吸光度，并且磷酸盐缓冲液降低吸光度。
5. 通过倒置混合内容，立即将比色杯放入分光光度计。用秒表观察OD 240处的吸光度降低2分钟。
6. 必须使用过氧化氢酶溶液作为对照。在试管中加入2.9ml PB，加入1ml 30mM H 2 O 2和100μl过氧化氢酶溶液（〜10单位）。记录1分钟内的初始和最终吸光度。使用2ml PB和1ml 30mM H 2 O 2 O 2作为空白。
7. 使用下式计算过氧化氢酶活性（Cuellar-Cruz等人，2009）
  
  其中
  是初始和最终吸光度之差。
  是反应的总体积（3ml）。
  240 （34.9mol ^-1 cm ^-1）。
  是比色皿的光程长度（1厘米）。
  是以ml为单位的样本体积。
  是样品的蛋白质浓度（mg/ml）
8. 来自C的提取物的过氧化氢酶活性的实例。 glabrata 菌株在指数生长期：
  
  注意：BG14菌株的过氧化氢酶活性在稳定期≈10U/mg更高。然而，cta1 Δ 的过氧化氢酶活性总是< 2 U/mg或无法检测。

笔记

对于过氧化氢酶，H 2 O 2 O 2分解对温度的依赖性小，因此可以在0至37℃之间进行测量，然而推荐20℃ 。
对于催化剂测定，每个测试比色皿将需要一次运行一个，所以不要准备下一个测试比色皿，直到前一个比色杯的运行完成。
使用低浓度的H 2 O 2 O 2以避免起泡。
通过使用石蜡膜可以促进样品的混合。

食谱

酵母提取物 - 蛋白胨 - 右旋糖肉汤（1L）
将10克酵母提取物和20克蛋白胨溶解在950毫升蒸馏水中
高压灭菌（121℃，15lb/in ² 15分钟）
加入50ml 40％（w/v）葡萄糖（最终2％;通过高压灭菌或过滤单独灭菌）
50mM磷酸盐缓冲液（PB）（pH7.0）（1L）将2.724g KH 2 PO 4溶解在400ml蒸馏水中
将5.34g Na 2 HPO 4溶解在600ml蒸馏水中
混合溶液[比例（1：1.5）]
用1M KOH pH调至7.0 为了获得细胞裂解物，制备10ml PB并加入一片cOmplete蛋白酶抑制剂。
30mM H 2 O 2（100ml）将0.26ml 35％H 2 O 2 Sub用PB稀释至100ml。对每个活性测定准备新鲜。溶液在实验过程中可以在室温下进行
过氧化氢酶溶液
将10mg过氧化氢酶冻干粉溶解在1ml冷PB/B中使用前，稀释5微升的过氧化氢酶溶液到1毫升冷PB，得到〜100 U/ml的溶液。 -20°C储存6个月。

致谢

该协议基于Aebi（1984）和Weydert和Cullen（2010）报道的方法。我们的适应方法首次发表在Cuellar-Cruz等人（2009）。这项工作是由CONACYT资助的。 CB-2010-153929，A.D.L.P. 最后，我们感谢Guadalupe Gutierrez-Escobedo的技术援助。

参考文献

Aebi，H。（1984）。体外过氧化氢酶。方法Enzymol 105：121-126。
Cuellar-Cruz，M.，Castano，I.，Arroyo-Helguera，O。和De Las Penas，A。（2009）。在机会性真菌病原体光滑假丝酵母中对甲萘醌和氢过氧化枯烯的氧化应激反应。 em> Mem Inst Oswaldo Cruz 104（4）：649-654。
Weydert，C.J。和Cullen，J.J。（2010）。在培养的细胞和组织中测量超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶 Nat Protoc 5（1）：51-66。