Fett，C.，DeDiego，M.L.，Regla-Nava，J.A.，Enjuanes，L.and Perlman，S。（2013）。通过用小鼠免疫在老年小鼠中完全保护免受严重急性呼吸综合征冠状病毒介导的致死性呼吸道疾病 - 适应缺乏E蛋白的病毒。 Virol 87（12）：6551-6559。

Netland，J.，DeDiego，M.L.，Zhao，J.，Fett，C.，Alvarez，E.，Nieto-Torres，J.L.，Enjuanes，L.and Perlman，在E蛋白中缺失的减毒性严重急性呼吸综合征冠状病毒的免疫保护免于致命的呼吸道疾病。 a> Virology 399（1）：120-128。

Zhao，J.，Zhao，J.and Perlman，S。（2010）。 T细胞应答对于严重急性呼吸综合征冠状病毒感染的小鼠中的临床疾病和病毒清除是必需的。 84（18）：9318-9325。

...

Trypsin-EDTA (T/E) (BioConcept, Amimed, catalog number: 5-5iF00-H)

Liquid nitrogen

DEPC BioChemica (AppliChem GmbH, catalog number: A0881, 0250)

100x Halt^TM Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 1861279)

RNase I (cloned) (100 U/µl) (Life Technologies, Ambion^®, catalog number: AM2294)

NaCl

Turbo DNase（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM2238）

山羊抗RENT1抗体（Bethyl Laboratories，目录号：A300-038A）（UPF1也称为RENT1）。

苯酚

氯仿

异戊醇

Dynabeads Protein G（Life Technologies，目录号：10004D）

碱性磷酸酶小牛肠（CIP）（New England Biolabs，目录号：M0290S）

T4 RNA连接酶（10U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EL0021）

RNasin（Dundee Cell Products，目录号：RS3100）

3'RNA接头（5'-P-UGAGAUCGGAAGAGCGGUUCAG-嘌呤霉素-3'）（Microsynth AG; http：//www.microsynth .ch/）
注意：RNA以5nmol等分试样递送，储存在-80℃，在使用前溶于25μlMQ-水中。

γ-P32-ATP（10μCi/μl）（HARTMANN ANALYTIC GmbH，目录号：SCP-401）

T4多核苷酸激酶（10U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EK0031）

4x NuPAGE LDS样品缓冲液（Life Technologies，目录号：NP0007）

20x NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液（Life Technologies，目录号：NP0001）

Prestained Protein Ladder（宽范围）（New England Biolabs，目录号：P7710S）

GlycoBlue 共沉淀剂（15mg/ml）（Life Technologies，目录号：AM9515）

蛋白酶K（重组PCR级）（Roche Diagnostics，目录号：03 115 887 001）

RT-引物（Microsynth AG）
寡核苷酸序列： 5'-P-NNNNAACAGATCGGAAGAGCGTCGTGGATCCTGAACCGC-3'

dNTP混合物（各10mM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0192）

AffinityScript ^TM Multi-Temp RT（Agilent，目录号：600109-51）

40％丙烯酰胺溶液（mix 19:1，分子生物学级）（AppliChem GmbH，目录号：A3658）

四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T22500-100ML）

过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号：A3678-100G）

PlusOne Repel-Silane ES（GE Healthcare，目录号：17-1332-01）

低分子量DNA梯（新英格兰Biolabs，目录号：N3233L）

SYBR 金核酸凝胶染料（Life Technologies，目录号：S11494）

CircLigase TM II ssDNA连接酶（震中，目录号：CL9025K）

Cut-Oligo（5'-GTTCAGGATCCACGACGCTCTTCAAAA-3'）（Microsynth AG）

BamHI（New England Biolabs，目录号：R0136S）

P5_Solexa引物（Microsynth AG）
寡核苷酸序列： 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'

P3_Solexa引物（Microsynth AG）
寡核苷酸序列： 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3'

Maximo Taq DNA 2X-Mastermix（GeneOn，目录号：S114）

DMEM -/- （每900ml）（参见配方）

DMEM +/+（每500ml）（参见配方）

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（见Recipes）

低渗温和裂解缓冲液（pH 7.5）（无RNase）（见配方）

IP洗涤缓冲液（不含RNase）（参见配方）

高盐洗涤缓冲液（pH 7.5）（无RNase）（见配方）

PNK缓冲液（pH 7.5）（不含RNase）（见配方）

PNK缓冲液，无DTT（pH 7.5）（无RNase）（见配方）

蛋白酶K缓冲液（pH 7.5）（无RNase）（见配方）

TE缓冲液（pH 7.5）（不含RNase）（参见配方）

10x Tris-硼酸盐缓冲液（TBE）（pH 8.0）（不含RNase）（参见配方）

酸性苯酚（参见配方）

解决方案A（不含RNase）（参见配方）

溶液B（不含RNase）（参见配方）

PAA-尿素凝胶（pH 8.0）（不含RNase）的装载缓冲液（参见配方）

10x DNA上样缓冲液（见配方）

DEPC处理的水/缓冲液（见配方）

3 M NaOAc（pH 4.6和5.5）（无RNA酶）（参见配方）

RNA连接混合物（参见配方）

激酶混合（参见配方）

CircLigation mix（见配方）

低聚退火混合物（参见配方）

PCR主混合物（参见配方）

设备

纯水系统：PURELAB Priama（Prima 7）和PURELAB ULTRA （Ultra Genetic）（ELGA LabWater）
注意：在此协议中，来自ELGA系统的纯水称为MQ-水。
CO 2培养箱（BINDER GmbH，型号：9140-0047）
Clear-view TM Snap-Cap微管（1.5ml，天然，低保留）（Sigma-Aldrich，目录号：T4816-250EA）
Multiply -Pro 0.2ml Biosphere （Sarstedt AG，型号：72.727）
过滤嘴（10μl，20μl和200μl）（Axon Lab AG，目录号：AL60X10，AL60X20，AL60X200）
过滤嘴（1,250μl）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：7.750.261）
15cm组织培养皿（TPP Techno Plastic Products，目录号：93150）
Stratalinker 2400（254nm）（Stratagene ，目录号：400076）
PCR管
电池升降器（TPP Techno Plastic Products，型号：99010）
Saran换装
苏格兰
GP Millipore Express PLUS膜（0.22μm）（500ml漏斗，45mm颈部尺寸）（EMD Millipore，目录号：SCGPT05RE）
DynaMag ^TM -2磁体（Life Technologies，目录号：12321D）
水浴（温度可调）
Eppendorf离心机5415R，带转子F45-24-11（Eppendorf，型号：022621459和022636502）
Criterion TM细胞（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-6001）
NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris Midi Gel（1.0mmx，12 + 2孔）（Life Technologies，目录号：WG1401BOX）
Midi Gel Adaptor（Life Technologies，型号：WA0999）
iBlot ^®凝胶转移装置（EU）（Life Technologies，型号：IB1001EU）
iBlot Transfer Stack（硝基纤维素，常规尺寸）（Life Technologies，目录号：IB3010-01）
10ml血清移液器
POWER PAC 3000（Bio-Rad Laboratories）
Lab循环仪梯度，配备有Thermoblock 96（SensoQuest GmbH，型号：011-101和012-103）
印花纸（Genentech，目录号：BP 002 46579）
FUJI屏幕
FUJIFILM FLA-3000磷光仪
Costar Spin-X 离心柱（Corning，型号：8161）
用于具有1mm厚隔离物和梳子（自制）的180×120mm凝胶的垂直PAA凝胶运行装置
回形针（51毫米）（Lyreco，目录号：161.791）
铝板（90×175mm，厚度3mm）
UV台（365 nm）（自制）
1ml注射器（BD，Plastipak TM，目录号：300013）

程序

细胞培养和UV交联
1. Hela细胞在补充有100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的10个15cm直径培养皿中的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养直到它们达到80％汇合。
2. 弃去培养基，用12ml冰冷的PBS缓冲液覆盖细胞
3. 使细胞经受150mJ/cm 2 UV-C光。在照射期间，将盘放置在冰上
4. 照射后，用10ml新鲜的冰冷PBS覆盖细胞，并使用细胞提升器刮下
5. 通过离心（4℃，200xg，5分钟）将细胞沉淀在两个50ml的falcon管中，在液氮中骤冷并储存直至在-80℃下使用。
有限的RNase I消化和UPF1免疫沉淀
1. 将细胞在冰上解冻并在7ml低渗温和裂解缓冲液中裂解20分钟。通过离心（4℃，13,000xg，15分钟）除去细胞碎片。回收上清液通过加入350μl的3M NaCl将NaCl浓度调节至150mM
2. 对于部分RNA酶消化，将RNase I在低渗温和裂解缓冲液中以1:1000稀释，并且用70μlRNase I稀释液和35μlTurbo DNase在37℃水浴中轻微摇动3分钟处理细胞裂解物。
  注意：对于每个进行iCLIP的RNA结合蛋白，必须重新调整RNase I消化步骤，以获得与感兴趣的蛋白质结合的80-200nt长的RNA片段，适用于cDNA文库制备和随后的高（见注释）。
3. 将RNase I处理的裂解物在冰上放置3分钟
4. 加入28μl山羊抗RENT1抗体，并在4℃下尾部旋转1小时
5. 将240μlDynabeads G蛋白G用1ml PBS缓冲液洗涤两次，并用1ml低渗温和裂解缓冲液洗涤一次。为了收集磁性Dynabeads ^？，使用DynaMag ^TM -2磁性机架。
6. 在用UPF1/RENT1抗体预孵育裂解物1小时后，加入洗涤过的珠，并在4℃下再孵育1小时。
7. 取出细胞裂解液，用IP洗涤缓冲液洗涤珠子3次
RNA的去磷酸化，随后3'-RNA-接头的连接
1. 为了使与UPF1共价结合的RNA片段去磷酸化，将Dynabeads重悬于60μl脱磷酸化混合物[55.25μlMQ-水，6.5μl10×NEBuffer3,3.25μl碱性磷酸酶小牛肠（CIP）]中并在37℃下温育20分钟。
2. 将珠用1ml高盐洗涤缓冲液洗涤两次用于严格洗涤，并用1ml PNK缓冲液洗涤两次
3. 在最后一次洗涤步骤后，小心地除去上清液，将珠子在50μlRNA连接混合物中温育。 3'RNA接头的过夜连接在0.2ml PCR管中进行置于16℃的PCR仪中。盖子保持在恒定的50℃，以防止样品冷凝
RNA的放射性标记和RNA-UPF1复合物的分离
1. 样品用1ml PNK缓冲液洗涤两次，并通过与60μl激酶混合物在37℃下温育，在800rpm下振荡45分钟，对RNA进行放射性标记。
2. 将结合到珠上的放射性标记的样品用不含DTT的PNK缓冲液洗涤四次（在第二次洗涤步骤之后保持放射性缓冲液，并用于步骤4i中的热定位标记）。
3. 通过在45μl1x NuPAGE LDS样品缓冲液中在90℃下烹饪5分钟，从珠粒上洗脱蛋白质-RNA复合物。
4. 凝胶流动装置使用BioRAD标准室，中间凝胶接头和预制的NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris midi凝胶组装。流动室装有500ml 1x NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液
5. 将洗脱的蛋白质-RNA样品（40μl）加载到NuPAGE Novex凝胶上，紧邻6μl预染色的蛋白梯，并在200V下分离45-60分钟，直到溴酚蓝运行前为约离开凝胶。
6. 拆卸凝胶装置并切断由溴酚蓝色带标记的正面。凝胶的下部含有未掺入的γ-P32-ATP，并作为固体放射性废物处理。
7. 使用iBlot系统将蛋白质-RNA加合物转移到硝酸纤维素膜上（有关详细说明，请参阅制造商提供的教程）。
8. 在7分钟的转移过程之后，转移堆叠被拆卸并作为固体放射性废物处理
9. 将硝酸纤维素膜包裹在纱布包装中，并且在膜的边缘处附着三个定位标记[1μl在步骤4b中放在一边的热PNK缓冲液铺在小的吸干纸条（1.5×8mm）上并固定在用苏格兰一小块苏珊包装。这些标记对于在步骤4k中适当地对准放射自显影以从UPF1-mRNA复合物与硝酸纤维素膜分离是重要的。]
10. 为了检测硝酸纤维素膜上的P32标记的RNA-UPF1复合物，将FUJI屏幕暴露1小时，并在FUJIFILM FLA-3000磷光仪上进行分析。
11. 膜的放射自显影图以真实抓取格式印刷并在定位标记的帮助下与硝酸纤维素膜对准。切下含有RNA-UPF1复合物的硝酸纤维素膜切片，并使用1,250μl移液管吸头将其研磨成小块。
12. 通过将膜片与200μl添加有20％（v/v）蛋白酶K的蛋白酶K缓冲液在50℃下温育1小时来分离RNA。
13. 重复洗脱以最大化洗脱效率
14. 使用costar Spin-X超声离心柱过滤（以2000×g离心2分钟）合并的洗脱级分（终体积400μl）。
苯酚/氯仿提取和RNA沉淀
1. 向过滤的RNA样品中加入一体积的酸性酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），并以1,000rpm（不涡旋）摇动5分钟。
2. 旋转样品（16,000×g，4℃，10分钟），并将水相（350μl）转移到新管中。
3. 加入35μl3M NaOAc（pH4.6），2μlGlycoBlue共沉淀剂，400μl异丙醇; 混合并在-20℃下沉淀RNA过夜
4. 通过离心（16,000×g，4℃，15分钟）沉淀RNA，用1ml 70％EtOH洗涤并溶解于5.5μlMQ-水中。
逆转录
1. 将样品转移到0.2 ml PCR管中
2. 向RNA中加入0.5μlRNasin，0.5μldNTP（各10mM）和0.5μlRT-引物（0.5pmol /μl）并加热至70℃5分钟（在PCR热循环仪中）。 >
3. 在将样品缓慢冷却至25℃（温度梯度：1.8℃/min）后，加入3μl以下RT混合物（1μl10x AffinityScript RT缓冲液，1μl0.1M DTT，1μlAffinity Script Multi-Temp RT）已添加。
4. 使用以下热程序继续逆转录：
  
  25°C
  15分钟
  
  50°C
  60分钟
  
  4°C
  保持
5. 将cDNA转移到1.5ml试管中，通过加入90μlTE缓冲液，0.5μlGlycoBlue共沉淀剂，10μlNaOAc（pH 5.5），250μl100％EtOH并随后在-20℃下温育过夜沉淀。 br />
6. 通过离心（4℃，16,000×g，15分钟）沉淀cDNA。
7. 用70％EtOH洗涤沉淀
8. 将cDNA重悬于10μlPAA - 尿素凝胶上样缓冲液中，并在70℃下煮5分钟。
9. 将2μl低分子量标记物与2μl6x上样缓冲液和8μlPAA - 尿素凝胶上样缓冲液混合（不要煮标记物）。
铸造6％TBE-脲凝胶
1. 小心清洗并干燥玻璃板（180 x 120 mm）。
2. 用柔软的纸巾将PlusOne反光硅烷ES涂在玻璃板的内表面上
3. 组装玻璃板和间隔（1 mm厚度），并用两个文件夹固定设置，两个文件夹位于间隔垫片的中心。将组装的玻璃板放在空的提箱上。将凝胶浇铸在水平位置使得填料的密封变得多余。
4. 通过混合7.5ml溶液A与17.5μl溶液B制备25ml 6％凝胶溶液。通过加入125μl10％APS和12.5μlTEMED开始聚合。
5. 将凝胶溶液用10ml血清移液管施加到玻璃板的将插入梳的一侧的边缘。玻璃板上的表面张力和轻微敲击确保了凝胶溶液的均匀和无气泡分布
6. 引入梳子，用附加的文件夹固定玻璃板。
7. 聚合凝胶1小时。
运行6％TBE-尿素凝胶
1. 将用铝板组装的凝胶夹入凝胶流动室（90×175×3mm铝板确保均匀的热分布，并且使凝胶中的样品均匀流动），并用1×TBE缓冲液填充该装置。 />
2. 用注射器小心地清洗插槽。
3. 预运行凝胶（10 W，30分钟）。
4. 再次洗涤插槽。
5. 加载低分子量DNA梯和cDNA样品，在其间留下2-3个空泳道
6. 运行凝胶（5 W，70分钟），直到溴酚蓝色条带在凝胶底部以上2厘米。
分离cDNA
1. 切割凝胶，以便从包含样品的泳道分离含有梯子的泳道
2. 在1x TBE缓冲液中用1x SYBR金染色含标记物的凝胶部分（15分钟），并将含有样品的凝胶部分包裹在saran包装中。
3. 可视化365nm紫外线桌上的DNA梯形图，并在透明度上复制尺寸梯形图的位置。
4. 借助于显示尺寸梯子（放置在未染色的凝胶部分旁边）的透明度，切除含有覆盖150-300nm大小范围的cDNA的凝胶部分。
5. 用注射器柱塞（从1ml注射器）压碎凝胶块，并用400μlTE缓冲液（在2,000rpm，37℃，2小时摇动）提取cDNA。
6. 用Costar Spin-X 离心柱（2分钟，2,000×g）过滤上清液。
7. 通过加入1μlGlycoBlue共沉淀，40μlNaOAc（pH 5.5）和1ml 100％EtOH沉淀cDNA，并在-20℃下孵育1小时。
8. 通过离心（4℃，16,000×g，15分钟）沉淀cDNA。
9. 用1ml 70％EtOH洗涤沉淀
10. 将cDNA溶解在6.7μlMQ-水中
通过环化和随后的线性化将5'引物引入cDNA
1. 为了进行环化，将1.5μlCircLigation混合物加入到6.7μlcDNA中，然后在PCR热循环仪中在60℃温育1小时。
2. 为了线性化单链环状cDNA，将DNA剪切寡核苷酸退火到RT引物中产生含有BamHI位点的双链DNA延伸的区域。
  准备寡核苷酸退火混合和添加30微升到环状cDNA的。将样品加热至90℃并缓慢冷却至25℃（在PCR热循环仪中，1℃/min温度梯度）。
3. 为了切割环状cDNA，加入2μlBamHI限制酶并在37℃下孵育45分钟
4. 通过加入50μlTE缓冲液，0.5μlGlycoBlue共沉淀，10μlNaOAc（pH 5.5）和250μl100％乙醇沉淀线性化的cDNA，然后在-20℃孵育过夜。
5. 通过离心（4℃，13,000×g，15分钟）沉淀线性化的cDNA。
6. 用70％EtOH洗涤沉淀
7. 将沉淀的cDNA溶于50μlMQ-水中
PCR扩增cDNA
使用P5_Solexa和P3_Solexa引物通过PCR引入高通量Illumina测序所需的衔接头。
1. 引导PCR
  为了确定cDNA文库的适当扩增所需的循环数，进行100μl测试PCR。为了设置测试PCR，将10μlcDNA，40μlPCR主混合物和50μlMaximo Taq DNA mastermix组合，并运行以下PCR程序：
  95℃5分钟
  34个循环（95℃45秒，50℃80秒，72℃1分钟）为了在循环20,22,24,26,28,30,32和34后分析中间PCR产物，取12μl样品并与3μl10x DNA上样缓冲液混合。
  每个样品在2.5％琼脂糖凝胶上分开7.5μl以确定产生刚好足够的PCR产物所需的循环数（N <阈值），导致在琼脂糖凝胶上可见的条带。应避免过度扩增，因为它大大降低了测序文库的复杂性
2. 制备PCR
  对于cDNA文库的制备性PCR扩增，以下列循环进行四个100μlPCR反应：
  95℃5分钟
  （95℃持续45秒，50℃持续80秒，72℃持续1分钟）的N个^阈值循环。
  72℃5分钟
3. 清理制备PCR产品
  将四种PCR产物合并，与400μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合，并在室温下尾部旋转5分钟。
  离心（4℃，13,000xg，15分钟）后，回收350μl水相，加入35μlNaOAc（pH 5.5），1μlGlycoBlue共沉淀剂和800μl100％EtOH，并沉淀在夜间在-20°C。
  通过离心（4℃，13,000xg，15分钟）沉淀cDNA文库，弃去上清液并用1ml 70％EtOH洗涤沉淀。
  将DNA溶解在20μlTE缓冲液中，加入3μlDNA加样缓冲液，并在2.5％琼脂糖凝胶上分离cDNA。使用Wizard SV凝胶PCR清除系统切除并分离DNA条带注意：不要使DNA变性，应尽快在50°C溶解凝胶！
提交您的cDNA文库，在Illumina HiSeq 2000测序仪上进行高通量测序，进行单端读数

图1.内源性UPF1的iCLIP程序。 iCLIP程序的示意图。 CIP，碱性磷酸酶小牛肠道。（从参考文献1改编的图）

笔记

在整个iCLIP协议中，Clear-view ^TM Snap-Cap微管用于最小化塑料对样品的吸收，从而防止样品损失。
NuPAGE ^？ Novex ^？ 4-12％Bis-Tris Midi Gel与NuPAGE ^？ MOPS SDS运行缓冲液的组合使用保持在运行程序期间保持恒定的pH 7，因此防止RNA进行碱性水解。
要成功地执行iCLIP，关键是建立一个有效的免疫沉淀（IP）协议优化您感兴趣的RNA结合蛋白。必须测试不同的抗体和各种缓冲液条件。
对于每种RNA结合蛋白，必须在有限的RNA酶消化步骤中测试不同的RNA酶I浓度，以获得具有用于cDNA文库制备和随后的高通量测序的合适大小（80-200nt）的RNA片段。特别是，与没有核苷酸特异性的RNase I一起，需要仔细滴定RNase I的工作浓度以防止RNA的过度消化。 1：50至1：2,000的RNA酶I稀释度似乎是初始滴定实验的合适范围。 Harsh RNA酶消化在蛋白质印迹后在放射自显影图上产生蛋白质-RNA加合物的清晰带。降低RNase浓度导致信号向更高分子量的转移，这是由于与蛋白质结合的RNA的大小的异质性增加（图2）。 80nt的RNA对蛋白质-RNA复合物贡献大约26kDa。

图2.免疫纯化和<32> P标记的RNA-蛋白复合物转移到硝酸纤维素膜的放射自显影图的示意图。在无抗体（无Ab）的情况下进行免疫纯化，缺乏RNA结合蛋白（KD）或未用UV-C光照射（无CL）是RNA-蛋白信号特异性的对照。 RNase I（1:50至1：2,000）的增加的稀释物诱导转移至较高分子量的免疫纯化的RNA-蛋白复合物。红色箭头标记游离RNA结合蛋白的电泳迁移率。
为了控制IP特异性，在IP过程中敲低目标蛋白质或省略抗体应当防止蛋白质-RNA复合物的积累。以相同的方式，当细胞不与UV光交联时，预期在蛋白质印迹的放射自显影图上不存在蛋白质-RNA复合物。游离放射性标记的RNA导致信号以低分子量运行（图2）。

食谱

注意：iCLIP协议中使用的所有缓冲液必须是无菌的，无核糖核酸酶的并且清洁污染的核酸。为了最小化污染，建议为iCLIP实验保留一套额外的试剂。所有缓冲液用MQ-水制备，并且如果可能用DEPC处理。 Duran瓶，玻璃器皿和铲子在180℃烘烤2小时。将聚碳酸酯或聚苯乙烯材料（例如磁力搅拌器）在3％过氧化氢或2M NaOH中浸泡10分钟，并在使用前用DEPC处理的水充分冲洗。如果缓冲液不能被DEPC处理（例如Tris缓冲液），则在DEPC或MQ-水中制备缓冲液，并用0.22μm过滤器过滤。

DMEM -/- （每900ml） 12克DMEM/F12粉末
2.48g NaHCO 3水溶液用ddH 2 O·
补充至900ml 用32％HCl或10M NaOH将pH调节至7.2 用瓶顶过滤器（0.22μm）过滤灭菌
DMEM +/+（每500ml）供应450毫升DMEM -/- 与50毫升FCS和5毫升P/S
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137 mM NaCl 10mM Na 2 HPO 4
2.7 mM KCl
2mM KH 2 PO 4 sub/
用HCl
调节pH至7.4
低渗温和裂解缓冲液（不含RNase）
10mM Tris-HCl（pH7.5） 10mM NaCl 2mM EDTA 0.5％（v/v）Triton X-100 在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
IP洗涤缓冲液（不含RNase）
50mM HEPES-NaOH（pH7.5） 300 mM KCl
0.05％（v/v）NP-40
0.5 mM DTT
在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
高盐洗涤缓冲液（不含RNase）
50mM Tris-HCl（pH7.5） 1 M NaCl
1mM EDTA
1％（v/v）NP-40
0.1％（w/v）SDS
0.5％（w/v）脱氧胆酸钠在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
PNK缓冲液（不含RNase）
50mM Tris-HCl（pH7.5） 10mM MgCl 2/
5 mM DTT
在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
无DTT（无RNase）的PNK缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 10mM MgCl 2/
在使用之前补充1x Halt ^TM蛋白酶抑制剂混合物
蛋白酶K缓冲液（不含RNase）
50mM Tris-HCl（pH7.5） 50mM NaCl 1％（w/v）SDS
10 mM EDTA
TE缓冲液（无RNase）
10mM Tris-HCl（pH7.5） 1mM EDTA
10x Tris-硼酸盐缓冲液（TBE）（无RNase）
890mM Tris 890mM硼酸 20mM EDTA（pH8）
酸性酚
在60℃下熔融苯酚
平衡2×MQ-水和0.1％羟基喹啉
将酚 - 水悬浮液在50ml falcon管中等分，并储存在-20℃下
解决方案A（无RNase）
20％聚丙烯酰胺（29:1） 1x TBE
8 M尿素
溶液B（无RNase）
1x TBE
8 M尿素
PAA-尿素凝胶的装载缓冲液（不含RNase）
20mM EDTA（pH8.0） 91％（v/v）去离子甲酰胺 0.5％（w/v）溴酚蓝
0.5％（w/v）二甲苯蓝
10x DNA上样缓冲液
0.6％（w/v）SDS
62.5％（v/v）甘油 0.5％（w/v）溴酚蓝
DEPC处理的水/缓冲液
水/缓冲液
0.1％（v/v）DEPC
搅拌过夜
高压灭菌两次以停用DEPC
3 M NaOAc（pH 4.6和5.5）（无RNA酶）
3 M NaOAc
用32％HCl调节pH至4.6和5.5
RNA连接混合物
28μlMQ-水
5μl用于T4核糖核酸酶连接酶的10x反应缓冲液
5μl1mg/ml BSA
1微升RNasin
10μl20μM3'RNA接头
1μl10 U /μlT4 RNA连接酶
激酶混合物
38μlMQ-水
6μl10x反应缓冲液A（用于正向反应）
10μl10μCi/μlγ-P32-ATP
6μl10 U /μlT4多核苷酸激酶
CircLigation mix
0.8μl10×CircLigase缓冲液II 0.4μl50mM MnCl 2/v/v 0.3μlCircLigase II
低温退火混合物
21μlMQ-水
4μl1mg/ml BSA
4μl缓冲液4
1μl10μM切割寡核苷酸
PCR主混合物
2.8μl100μMP5_Solexa
2.8μl100μMP3_Solexa
194.5μlMQ-水

致谢

我们感谢用于初始生物信息学支持的R. Bruggmann和S. Neuenschwander（伯尔尼大学的细胞生物学研究所），以及H.le Hir（Institut de Biologie，ÉcoleNormaleSupérieure，Paris，France），用于技术提示剪辑。该方案被优化以研究UPF1的RNA结合位点，并且基于先前描述的研究（Konig等人，2010; Konig等人，2011; Hafner et al。， 2010）。此外，我们要感谢Mihaela Zavolan（瑞士巴塞尔瑞士生物信息学研究所），Jernej Ule（英国剑桥的分子生物学医学研究委员会实验室）在设置这些实验方面的技术支持，Andreas R. Gruber（Swiss Institute of Bioinformatics，Basel，Switzerland）进行生物信息学分析。

参考文献

Zünd，D.，Grüber，A.R.，Zavolan，M。和Mühlemann，O。（2013）。翻译依赖于UPF1从编码序列的置换导致其在3'UTR的富集。 Nat Struct Mol Biol 20（8）：936-943。
König，J.，Zarnack，K.，Rot，G.，Curk，T.，Kayikci，M.，Zupan，B.，Turner，D.J.，Luscombe，N.M.and Ule，J.（2010）。 iCLIP揭示了hnRNP颗粒在单个核苷酸分辨率剪接中的功能。 Nat Struct Mol Biol 17（7）：909-915。
König，J.，Zarnack，K.，Rot，G.，Curk，T.，Kayikci，M.，Zupan，B.，Turner，D.J.，Luscombe，N.M.and Ule，J。 iCLIP-转录组范围内的蛋白质-RNA相互作用与单个核苷酸分辨率的映射。 a> JoVE （50）。
Hafner，M.，Landthaler，M.，Burger，L.，Khorshid，M.，Hausser，J.，Berninger，P.，Rothballer，A.，Ascano，M.，Jr.，Jungkamp，AC，Munschauer，M Ulrich，A.，Wardle，GS，Dewell，S.，Zavolan，M。和Tuschl，T。（2010）。 PAR-CLIP对RNA结合蛋白和微小RNA靶位点的全转录组鉴定。 141（1）：129-141。