材料和试剂

拟南芥种子[arp6-3 ，swc6-1 和敏感 ku70-2 的野生型和T-DNA插入行/em>（Rosa et al。，2013）。所有突变体都在哥伦比亚-0背景中。]
次氯酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：425044）
吐温-80（Sigma-Aldrich，目录号：4780）
无菌H 2 O 2/b
固体培养基

材料和试剂
1. 拟南芥种子[arp6-3 ，swc6-1 和敏感 ku70-2 的野生型和T-DNA插入行/em>（Rosa et al。，2013）。所有突变体都在哥伦比亚-0背景中。]
2. 次氯酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：425044）
3. 吐温-80（Sigma-Aldrich，目录号：4780）
4. 无菌H 2 O 2/b
5. 固体培养基
  ...
设备
1. 无菌罩，优选生物安全柜，以避免暴露于基因毒素
2. 台式块振动器（如 Eppendorf，Thermomixer ^®）
3. UV交联剂（254nm UV灯泡，每种15瓦）（Stratagene，型号：Stratalinker 2400）
4. γ照射源（Nordion，型号：Co-60-γ电池220）
5. 镊子
6. 箱或铝箔
7. 用固体生长培养基（见注释）（圆形200×15mm和55×15mm，方形100×100×15mm）的植物培养用培养皿。
8. 1.5 ml Eppendorf管
9. 植物生长设施，在21℃下，16小时光/8小时黑暗循环
程序
1. 种子灭菌
  1. 在1.5ml Eppendorf管中用1ml灭菌溶液洗涤种子，在块振荡器中在室温下以300rpm振摇6分钟。使种子固定在Eppendorf的底部并除去上清液。用1ml无菌水洗涤5次，在振荡器中5分钟。最后一次洗涤后，取出上清液，在封闭的无菌罩中干燥过夜，留下管子开口注意：每个基因型和治疗消毒约350粒种子。所有涉及种子或苗子操作的后续步骤应在无菌罩中进行。
2. 真叶测定
  1. 使用火焰灭菌和冷却的镊子将板种子在固体生长培养基（每板约75至100个）中。在4℃下在黑暗中（在盒中或包裹在铝箔中）分层2至4天，并转移到具有照明的生长室。
    注意：任何其他无菌电镀技术都是合适的。每个板做一个生物复制;对于每个数据点，应当分析至少3个生物重复。
  2. 治疗
    1. γ辐射：用100-Gray脉冲（Gy）用Co-60-γ源以27-34Gy/min的剂量处理4日龄幼苗。将板置于标准生长条件下恢复6天直到分析。
      注意：4日龄=转移到生长室后4天。
    2. Bleocin和丝裂霉素C：使用火焰灭菌和冷却的镊子，将4天龄的幼苗转移到含有10ml液体生长培养基的小培养皿中，其不含（mock）或含有药物（1μg/ml bleocin或10 μg/ml丝裂霉素C）。在照明的生长室（9天龄的幼苗）中孵育5天（幼苗漂浮在液体中，但没有摇动）后，除去培养基，通过用20ml液体培养基浸渍板5次彻底洗涤。使用火焰灭菌和冷却镊子转移幼苗到固体板。允许幼苗恢复24 h前分析。
      注意：幼苗应仔细挑选和处理，避免镊子损坏。结果的实例参见图1A-C。
    3. 羟基脲：直接在板上种子种子，没有或含有1mM的化学物质，并在标准条件下生长直到在第10天进行分析。
  3. 分析
    在第10天，将板照片以供参考，并对"具有真叶的植物的百分比"进行评分注意：
    1. 在未受干扰的发育中，10天龄的拟南芥幼苗具有一对真叶。
    2. DNA损伤导致顶端分生组织中的细胞停止分裂，使得没有真正的叶发育（图1A）。
    3. 对于定量测定，计算每个处理群体的具有真叶的植物的百分比与模拟处理后具有真叶的植物的数目的关系。这种计算将DNA损伤治疗与其他因素，如突变体的活力或环境因素分开。
    4. 只有成对的和正常形状的叶片才能打分;单个或小而窄的未膨胀叶片不被视为真叶。
3. 紫外线损伤测定
  1. 使用火焰灭菌和冷却的镊子将板种子在固体生长培养基（每板约75至100个）中。在4℃下在黑暗中（在盒子中或包裹在铝箔中）分层2至4天，并用照明转移到生长室。
    注意：每个板块做一个生物复制;对于每个数据点，应当分析至少3个生物重复。
  2. 在Stratalinker中，用3kJ/m 2 UV-C处理幼苗生长的第4天。在标准条件下生长直至第12天，并对抗性植物的百分比进行评分（图1D）。敏感植物具有表型，例如减小的总体大小，氯化子叶和衰老，而抗性植物具有正常的大小范围并保持绿色。注意：用模拟处理中的相同参数除以处理群体中的值，并平均生物重复。
    治疗前用70％乙醇消毒Stratalinker内部，运行3分钟与最大剂量的UV-C。然后将板放在里面，取下盖子，保持它在Stratalinker内。快速关闭门，以避免污染并运行所需剂量的UV-C。当治疗完成时，关闭板仍然在Stratalinker内，并恢复到正常生长条件
    
    图1.结果实施例（A）10天龄bleocin处理的幼苗的表型（ i ，箭头） em>）true叶。（B）真叶测定显示野生型，arp6-3 ，swc6-1 和 ku70-2 对不同剂量的bleocin 。每个绘制值对应于使用60-80个幼苗的一个实验的评分。（C）用1μg/ml bleocin处理的幼苗的真叶测定。相对于模拟样品计算10-d-处理的具有真叶的植物的百分比。条形图描绘了3至5次实验之间的平均值，每次处理75至100个幼苗。（D）12天龄的UV-C处理的抗性（ i ）和敏感（ ii ）幼苗的表型。（E）用3kJ/m 2的UV-C处理的幼苗的抗UV试验。条形图描绘了4次实验之间的平均值，每次处理75至100个幼苗。星号表示根据来自未配对试验的P值的处理和未处理样品之间的显着性：*** P < 0.001和** 0.001 < P < 0.01。
笔记
1. 为了更好地表征不同基因型对DNA损伤剂的反应，产生具有至少3种不同浓度的基因毒素的响应曲线（图1B中的实例）：50至200Gy的γ-照射，0.5至2mg/ml bleocin，5至20丝裂霉素C，0.5至2的羟基脲和1.5至6kJ/m 2的UV-C。
2. 始终保持板属于一个实验（模拟+处理）并排生长。例如，将生长室中的模拟和γ辐照处理板同时取出
3. 在该实验中，我们使用Rosa等人（2013）中描述的萌发培养基（GM）（详细方案可在 http://www.gmi.oeaw.ac.at/download/gm_medium_protocol_oms.pdf ）。我们没有测试过使用常规MS培养板，但没有理由相信培养基会成为决定性因素，只要每个实验中使用的培养板来自同一批培养基。
食谱
1. 种子灭菌溶液
  5％次氯酸钠和0.05％Tween-80 将500μl次氯酸钠和5μl吐温-80在10ml无菌H 2 O中混合
2. Bleocin（工作溶液：1μg/ml;原液：10mg/ml）将100mg的Bleocin溶解在10ml H 2 O中使0.2毫升等分试样，并保持在-20°C，直到使用
  避免解冻/冻结周期
  在液体培养基中稀释至所需浓度，使用一次性50ml Falcon管
3. 丝裂霉素C（工作溶液：10μg/ml;原液：0.5mg/ml）在使用前立即将2mg丝裂霉素C溶于4ml H 2 O中
  在液体培养基中稀释至所需浓度，使用一次性50ml Falcon管
致谢

我们感谢维也纳大学营养科学系帮助辐射实验和GudrunBöhmdorfer对DNA损伤剂的有益讨论。工作得到来自奥地利联邦科学和研究部的Grants GEN-AU GZ 200.140-VI/1/2006和来自奥地利科学基金的FWF P18986-B17的支持。该协议在Rosa等人（2013）中建立。

参考文献
1. Rosa，M.，Von Harder，M.，Cigliano，R.A.，Schlögelhofer，P.and Mittelsten Scheid，O。（2013）。拟南芥 SWR1染色质重塑复合物对于DNA修复，体细胞重组和减数分裂是重要的。植物细胞 25（6）：1990-2001。