材料和试剂

细胞系：INT 407，Hep-2，Hela，HT-29（可从ATCC和其它商业来源获得）
霍乱弧菌经典生物型菌株O395
将Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ）
1. 高葡萄糖（4500mg/L）（目录号：12800-017）
2. 低葡萄糖（1,000mg/L）（目录号：31600-034）
3. 无葡萄糖（目录号：11966-025）
新生小牛血清（NCS）（未热灭活）（Life Technologies，Gibco ，目录号：16010-159）
10x胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：15400）
TritonX-100（Affymetrix，目录号：T1001）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：C6164）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
D-半乳糖
10×细胞裂解缓冲液（Cell Signaling Technology，目录号：9803）
pNPP（5mg）（Sigma Chemical，目录号：N-9389）
细菌胰蛋白胨（BD，Difco ^TM，目录号：211705）
细菌酵母提取物（BD，Difco ，目录号：212750）
Bacto琼脂（BD，Difco ^{TM，目录号：214010）}
NaHCO 3（Merck KGaA）
NaCl（Merck KGaA）
Na 2 HPO 4（Merck KGaA）
KCl（Merck KGaA）
（Merck KGaA）。
70％乙醇（Merck KGaA）
NaOH（Merck KGaA）
个人防护用品（围裙，手套，面具等）
Bio-Rad蛋白测定染料试剂（Bio-Rad Laboratories）
完成DMEM（100 ml）（参见配方）
不完全DMEM（100 ml）（参见配方）
无葡萄糖完全DMEM（100ml）（见配方）
10x PBS（500ml，pH7.4）（参见Recipes）
1x PBS（50ml）（见配方）
1x胰蛋白酶-EDTA（10ml）（参见配方）
1％Triton X-100（50ml）（参见配方）
0.9％盐水溶液（见配方）
LB培养基（100ml）（参见配方）
LB琼脂（100ml）（见配方）
碱性磷酸酶测定缓冲液（10ml）（参见配方）

设备

25cm 2组织培养处理的烧瓶（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353108）。
无菌，一次性15 ml和50 ml离心管
无菌，一次性1.5 ml微量离心管
无菌微尖端
无菌cryovials
细胞刮刀（BD Biosciences，Falcon ）
0.22μm过滤器单元（Millex-GP）（Millipore，目录号：SLGP033RS）
CO <2>孵化器
层流罩
液氮储存容器
倒置显微镜
离心机
微量离心机
Pipetteman
紫外可见分光光度计

程序

注意：为了处理细胞系和细菌培养物，必须使用无菌技术，并且如果可行，应在无菌层流罩中进行操作。

细胞系的培养
1. 使用储存在液氮（参见注释1）中的所选择的细胞系（约10 6个细胞）的等分试样接种25cm 2组织培养瓶，其含有5 ml完全DMEM。在37℃，5％CO 2加湿气氛中，将培养物生长至70-80％汇合（约4×10 6个细胞）。 INT 407在低葡萄糖完全DMEM中生长，Hep-2，Hela和未分化HT-29在高葡萄糖完全DMEM中生长。分化（参见注释2）HT-29在10％CO 2加湿气氛下在无葡萄糖的完全DMEM中生长。
2. 将培养物用5ml 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次，并加入4ml低葡萄糖不完全DMEM。
细菌细胞培养
1. 一个循环的 V。在含有20％甘油的LB培养基中于-70℃保存的霍乱菌株O395在LB琼脂平板上划线并在37℃下孵育16-18小时。
2. 一个循环的 V。霍乱弧菌培养物接种到5ml LB培养基中并在37℃下通气（在旋转振荡器中以约200rpm振摇）生长16-18小时。从该培养物中，将1％接种物（50μl）加入到5ml LB培养基中，并在37℃下振荡生长至中对数期（OD <600）。
3. V。霍乱菌培养物离心（5,000×g，5分钟），用5ml 1x PBS洗涤，并悬浮于浓度为10μM的低葡萄糖不完全DMEM中。菌落形成单位（CFU）/ml（来自LB培养基中约2ml对数期培养物的细菌细胞悬浮于1ml不完全DMEM中）。
细菌粘附于细胞系
1. 使用在25cm 2烧瓶中生长至70-80％汇合的细胞系。
2. V。将在低葡萄糖不完全DMEM中的霍乱弧菌培养物（200μl，约2×10 8 CFU）加入到70-80％汇合的细胞系中，得到的感染复数（MOI）约为50.
3. 在添加细菌后，将细胞系在37℃下在5％CO 2加湿气氛中温育45分钟以获得最佳粘附。
4. 45分钟后，弃去上清液，通过用5ml 1x PBS洗涤感染的细胞系4次除去未粘附的细菌，然后加入低葡萄糖完全DMEM（5ml）并孵育不同的时间（1- 12小时）。
5. 在所需的时间后，弃去上清液，用5ml 1x PBS洗涤感染的细胞系4至5次。
6. 加入1ml 1％Triton X-100，在室温下温和涡旋孵育2分钟，此时可以看到细胞系从烧瓶中裂解和分离。在1.5中收集总培养物 ml微量离心管，并进行强力吸液或涡旋。 Triton X-100处理裂解真核细胞，但对细菌细胞的活力没有影响（见注3）。
7. 在室温下通过离心（5,000×g，5分钟）收集细菌细胞，并将沉淀悬浮在1ml 1×PBS中。
8. 从该悬浮液中，将10μl加入990μl的0.9％盐水溶液中，通过连续稀释和铺板在LB琼脂平板上测定细菌CFU。剩余的粘附细菌细胞可用于基因表达研究或其他目的。
9. 在相同条件下用霍乱弧菌进行平行实验，但没有细胞系作为未粘附对照。

笔记

将细胞系储存在具有10％DMSO作为冷冻保护剂的液氮中。
HT29分化
1. 基本上如Huet等人（1987）所述进行HT29细胞的分化。
  1. 未分化的HT29细胞在25cm 2烧瓶中的高葡萄糖完全DMEM中生长至70-80％融合。
  2. 加入1ml含有0.5％胰蛋白酶和1mM EDTA的溶液，在约5分钟后，将分离的细胞用于接种25cm 2烧瓶不含补充有20mM葡萄糖和1mM葡萄糖的完全DMEM mM半乳糖（第0天）
  3. 然后下面的日程表随后逐渐增加半乳糖的浓度至5mM 并降低葡萄糖的浓度：（a）第1天，15mM葡萄糖加 1mM半乳糖; （b）第2天，10mM葡萄糖加3mM半乳糖; （c）天 3，5mM葡萄糖加4mM半乳糖; （d）第4天，5mM半乳糖。的在4天的时间内每天更换培养基。一旦适应，细胞在无葡萄糖的完全DMEM中生长几代（5mM）。
2. 碱性磷酸酶（AP）活性被估计为HT29分化的标志物（Luongo等人，2002）。
  1. 分化的和未分化的HT29细胞从中释放通过用1ml胰蛋白酶（0.5％） - EDTA（1mM）处理， mM）溶液，用1ml冷的1×PBS洗涤3次，并在冰上裂解用1x细胞裂解缓冲液。
  2. 对于AP活性测定，50μl细胞裂解物与1ml< 磷酸对硝基苯酯（1mg/ml）测定缓冲液在室温下30分钟，并停止反应通过加入100μl的0.1M K 2 HPO 4。
  3. 计算AP活性作为在405nm（A <405）/mg总细胞蛋白质的吸光度。针对没有底物温育的裂解物测量A 405。
  4. 总蛋白通过Bradford方法使用Bio-Rad蛋白测定染料试剂估计。
为了检查1％Triton X-100处理是否对细菌细胞有任何影响，将细菌培养物（OD大约600）分成2等份，一份用Triton X-100处理 2分钟，测定经处理和未处理的培养物的CFU。如果两种培养物的CFU相当，则可以认为1％Triton X-100处理对本研究中使用的细菌细胞的存活率没有影响。

食谱

完成DMEM（100 ml）
1.0 g DMEM（低或高葡萄糖）
0.37克碳酸氢钠 10ml NCS（在56℃水浴中热灭活30分钟）用去离子水将体积调节至100ml 使用0.22μm过滤器单元过滤
储存在4°C
不完全DMEM（100 ml）
1.0g DMEM（低葡萄糖）
0.37克碳酸氢钠用去离子水将体积调节至100ml 使用0.22μm过滤器单元过滤
储存在4°C
无葡萄糖完全DMEM（100ml）
89ml液体DMEM（无葡萄糖）
10ml热灭活NCS
使用0.22μm过滤器单元过滤
储存在4°C
10x PBS（500ml，pH7.4） 40.0g NaCl
1.0克KCl
6.07g Na 2 HPO 4
1.0g KH 2 PO 4 sub/
用去离子水将体积调节至500ml，如果需要，用NaOH调节pH值
高压灭菌
1x PBS（50ml）
将5ml在45ml去离子水中稀释的10x PBS稀释使用0.22μm过滤器单元过滤
1x胰蛋白酶-EDTA（10ml） 1ml用9ml无菌1×PBS稀释的10×胰蛋白酶-EDTA 将1ml等分试样分散在离心管中储存在4°C
1％Triton X-100（50ml） 0.5ml 100％Triton X稀释在49.5ml无菌1x PBS中
0.9％盐水溶液
0.9g NaCl在100ml去离子水中的溶液高压灭菌
LB培养基（100ml） 1克细菌胰蛋白胨（1％）
0.5克细菌酵母提取物（0.5％） 0.5克NaCl（0.5％）用去离子水将体积调节至100ml，用NaOH将pH调节至8.6 高压灭菌
LB琼脂（100 ml）
100ml LB培养基
1.5克Bacto琼脂（1.5％）用去离子水将体积调节至100ml，用NaOH将pH调节至7.4 高压灭菌
碱性磷酸酶测定缓冲液（10ml） 1ml 1M Tris/HCl（pH9.5）（终浓度100mM） 50μl1M MgCl 2（终浓度5mM）用去离子水调节至10ml体积高压灭菌

致谢

该协议改编自Huet等人（1987）; Luongo等人（2002）; 和Dey等人（2013）。

参考文献

Dey，A.K.，Bhagat，A.and Chowdhury，R。（2013）。宿主细胞接触诱导毒力因子和VieA（一种环状二-GMP磷酸二酯酶）的表达 > Vibrio 霍乱。细菌 195：2004-2010。
Huet，C.，Sahuquillo-Merino，C.，Coudrier，E。和Louvard，D。（1987）。从多能肠细胞系（HT-29）分离的吸收和分泌粘液的亚克隆提供了新的模型用于细胞极性和末端分化。细胞生物学 105：345-357
Luongo，D.，Mazzarella，G.，Della，R.F.，Maurano，F.and Rossi，M。（2002）。在肠细胞系HT-29分化过程中ERK1和ERK2活性的下调。 a> Mol Cell Biochem 231：43-50。