材料和试剂

[γ-32 P] ATP，[32] P]（Amersham Biosciences）
Poly P（类型15和75）（腺苷三磷酸双磷酸酶和常见化学品）（Sigma-Aldrich）
Poly P Sub 35，Poly P 50，Poly P 300和Poly P 750中的至少一种。
从酵母中分离的多磷酸酶（PPX）
从大肠杆菌（大肠杆菌）（EcPPK）分离的多磷酸激酶（PPK）
Tris-HCl（pH 8.0）
硫酸铵
甲苯胺蓝
25％甲醇
5％甘油
5x样品缓冲液（见配方）
THK缓冲区（参见配方）
洗脱缓冲液（见配方）
丙烯酰胺溶液（参见配方）

设备

DE81磁盘
Monolight 2010（分析发光实验室）
Topcount（Packard Instruments）
Microfuge（14,000 rpm或16,000 x g ）
磷光体（分子动力学）（常规）
柯达X-Omat AR电影

程序

注意：此协议可以适用于任何类型的提取。用于聚P定量的样品量取决于样品中多聚P的总量，并且实验应确定正确的稀释度。

提取和定量
1. 在4℃下提取酸溶性和盐溶性聚P级分与0.5N HClO 4和在1N HClO 4中的NaClO 4的饱和溶液混合，分别。
2. 剩余的生物质在90℃下用0.5N HClO 4处理30分钟，并测量酸不溶性聚P部分的水平释放的量（Vagabov等人，2000）。
3. 通过吸附到Norit A炭上从酸可溶性级分中去除核苷酸（Ault-Riche等人，1998）。
4. 在酸溶性和盐溶性聚P中聚P的水平分数计算为P值之前和之后的差异在100℃下在1N HCl存在下水解样品10分钟 ℃（不稳定磷）。
5. 并行使用DE81滤纸处理以估计聚P的量（Rao等人，1998）。
6. 将细胞裂解物的等分试样（20μl）加载到DE81盘（1.3μm）上 cm直径）并置于纸巾上2至5分钟以干燥。
7. 通过在10ml THK缓冲液中振荡将每个盘洗涤三次。
8. 然后将部分空气干燥的盘置于0.5-ml Eppendorf管中没有盖子和在底部有一个小孔; 管带盘然后置于1.5-ml Eppendorf管中。
9. 聚P 通过将盘浸泡在缓冲液中用50μl洗脱缓冲液洗脱在室温下孵育10分钟，然后将管离心5秒在微型离心机中以14,000rpm; 重复用50μl缓冲液洗脱三次。
10. 向合并的200μl洗脱液中加入2μl 的P型P 65型（20μg）和6μl的15％Norit悬浮液水。
11. 将悬浮液混合并在微量离心机中以14,000rpm离心5分钟
12. 将上清液转移到新鲜的Eppendorf管中，沉淀用400μl10mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）洗涤两次。
13. 合并上清液以产生1.0ml的总体积，其构成纯化的聚P提取物。
14. 使用牛血清白蛋白作为标准测定蛋白质水平。
15. 为了估计总P值，我们使用了Ault-Riché的方法（Ault-Riche等人，1998; Rao等人，1998），其中酶测定法用来自E的纯化的PPK进行。大肠杆菌（Ec-PPK）; 在......的存在下 ADP和聚P，ATP，并使用发光测量如（Ault-Riche和Kornberg，1999）所述。
Poly P测定
1. 0.1ml反应混合物
  50mM Tris-HCl（pH7.4） 40mM硫酸铵 4mM MgCl 2/
  5μMADP
  24,000U Ec-PPK（纯酶）
  在37℃孵育40分钟，然后在90℃孵育2分钟。
2. 将反应混合物在100mM Tris-HCl（pH 8.0）-4中以1:100稀释 mM EDTA，其中0.1ml加入0.1ml荧光素酶反应中混合物。
3. 使用发光计（Monolight 2010或Topcount）测量发光。
4. ATP（0,0.55,1.1,1.65和3.3pmol）在100mM中的标准曲线 Tris-HCl（pH8.0）-4mM EDTA用于比较。
5. 聚P的浓度以P 1i残基的形式给出。 p P 值基于特定的放射性和易感性用PPX水解。
通过尿素-PAGE的聚P分析
1. 通过混合以下物质制备脲 - 聚丙烯酰胺凝胶：
  10.51克尿素 3.75ml丙烯酰胺溶液 2.5ml 0.9M Tris硼酸盐（pH8.3） 27mM EDTA，至终体积为25ml
  过硫酸铵（15μg）和TEMED（25μl）
2. 将凝胶倒入（14×23×0.75mm）中并使其聚合。
3. 其他强度的凝胶用适当体积的股票丙烯酰胺溶液。将凝胶在300V下预电泳1 H。
4. Poly P与0.25体积的5x样品缓冲液混合，并装载在凝胶上
5. 电泳在300V下进行，直到染料距离凝胶顶部7至8cm。
6. 凝胶用：
  染色 0.05％甲苯胺蓝在25％甲醇和5％甘油中的溶液处理20分钟，随后进行在不含甲苯胺蓝的相同溶剂中脱色。
7. 凝胶在Phosphorimager上分析含荧光的放射性在Kodak X-Omat AR膜上的放射自显影（Kumble和Kornberg，1995）。
8. 为了测定链长，使用各种大小的标记聚P 连同样品和被定位的标记一起电泳甲苯胺蓝染色（图1）。
9. 绘制厘米迁移的对比链长度，样品的迁移率测量，并且其链长度通过从的外推确定
10. 凝胶用：
  染色 0.05％甲苯胺蓝在25％甲醇和5％甘油中的溶液处理20分钟，随后进行在不含甲苯胺蓝的相同溶剂中脱色。
11. 凝胶在Phosphorimager上分析含荧光的放射性在Kodak X-Omat AR膜上的放射自显影（Kumble和Kornberg，1995）。
12. 为了测定链长，使用各种大小的标记聚P 连同样品和被定位的标记一起电泳甲苯胺蓝染色（图1）。
13. 绘制厘米迁移的对比链长度，样品的迁移率测量，并且其链长度通过从的外推确定... Recipes
  1. 5x sample buffer
    50% sucrose
    0.125% bromophenol blue
    450 mM Tris borate at pH 8.3
    13.5 mM EDTA
  2. THK buffer
    10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
    100 mM KCl
    5 mM KPO₄ (pH 8.0)
  3. Elution buffer
    10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
    500 mM KCl
  4. Aacrylamide solution
    38 g of acrylamide and 2 g of bisacrylamide dissolved in deionized water to a final volume of 100 ml
  Acknowledgments
  
  This protocol is adapted from Ault-Riche et al. (1998); Ault-Riche et al. (1999); Rao et al. (1998); and Zhang et al. (2007).
  
  References
  1. Ault-Riche, D. and Kornberg, A. (1999). Definitive enzymatic assays in polyphosphate analysis. Prog Mol Subcell Biol 23: 241-252.
  2. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M. and Kornberg, A. (1998). Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. J Bacteriol 180(7): 1841-1847.
  3. Kumble, K. D. and Kornberg, A. (1995). Inorganic polyphosphate in mammalian cells and tissues. J Biol Chem 270(11): 5818-5822.
  4. Rao, N. N., Liu, S. and Kornberg, A. (1998). Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. J Bacteriol 180(8): 2186-2193.
  5. Vagabov, V. M., Trilisenko, L. V. and Kulaev, I. S. (2000). Dependence of inorganic polyphosphate chain length on the orthophosphate content in the culture medium of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry (Mosc) 65(3): 349-354.
  6. Zhang, H., Gomez-Garcia, M. R., Shi, X., Rao, N. N. and Kornberg, A. (2007). Polyphosphate kinase 1, a conserved bacterial enzyme, in a eukaryote, Dictyostelium discoideum, with a role in cytokinesis. Proc Natl Acad Sci U S A 104(42): 16486-16491.