材料和试剂

小鼠（FvBN株）
PC3细胞（ATCC，目录号：CRL 7934）
L929细胞（ATCC，目录号：VR-1404）
DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：D2902）
MEM-α（Sigma-Aldrich，目录号：M0644）
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，HyClone目录号：SH3008803）
青霉素 - 链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：25200-056）
1x无菌PBS（Sigma-Aldrich，目录号：P3813）
70％乙醇
RNeasy Plus迷你包（QIAGEN，目录号：74134）
QIAshredder（QIAGEN，目录号：79654）
RLT缓冲液（RNeasy Plus Mini Kit的一部分，如上所示）包括2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M7522）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
MES（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
完成DMEM（参见配方）
L929条件培养基（见配方）
BMM媒体（参见配方）
SME裂解缓冲液（参见配方）

设备

6孔板（Corning，Costar ，目录号：3516）
Transwell插入物（Corning，目录号：3412）
培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：08-757-13）
100mm组织培养皿（Corning，目录号：430293）
T75烧瓶（Corning，目录号：430725）
细胞刮刀（SARSTEDT AG，目录号：83.1830）
无菌细尖移液管（Thermo Fisher Scientific，目录号：232-1S）
10ml注射器（Luer-Lok）（BD，目录号：309604）
5，10，& 25 ml血清移液器
针（26Gauge& 20Gauge）（BD，目录号分别为305111& 305176）
解剖钳和剪刀
Scalpel
1.5ml管（Thermo Fisher Scientific，目录号：3464）
15ml离心管（Thermo Fisher Scientific，Nunc ，目录号：339650）
50ml离心管（Thermo Fisher Scientific，Nunc ，目录号：339652）
5 K Millipore离心浓缩器（Amicon Ultra-4）（Millipore，型号：UFC800596）
离心机
培养箱（5％CO 2，37℃）（Napco系列8000 DH CO 2培养箱）
生物安全柜（The Baker Company，SterilGARD ^®）

程序

从小鼠骨髓获得BMM
1. 使用CO 2吸入和颈脱臼的牺牲供体小鼠（雄性，6-8周龄，内部繁殖）。
2. 在无菌罩，用70％乙醇冲洗后腿和删除，使肯定切开股骨头以上。将皮肤的腿放在陪替氏培养皿中 1×无菌PBS
3. 去除骨骼的肌肉和结缔组织（股骨和胫骨），用手术刀和放置刮他们到新鲜的1×无菌PBS中
4. 放置新鲜的手术刀和解剖镊子放入烧杯中的70％乙醇。从PBS中取出一根骨头干燥培养皿，切开骨头两端，暴露骨髓。
5. 使用 26号针和10ml注射器，钻入骨髓并缓慢使用BMM培养基冲洗出骨髓到50ml离心管中。冲洗2 ml 从一侧，翻转骨，从另一侧冲洗2毫升 - 共4毫升每个骨骼
6. 对所有4个骨头重复步骤A5到1×50ml离心管中
7. 使用20号针和10ml注射器，轻轻混合细胞悬浮4x通过吸入注射器破碎任何团块
8. 使BMM培养基和细胞的体积达到36ml。板进入3x培养皿每个100mm培养皿（〜9-10×10 6个细胞/培养皿）中培养。允许细胞在细胞培养箱中不受干扰地生长〜84小时（在37℃， 5％CO 2）。
  注意：使用培养皿代替处理的细胞培养板以允许BMM的更容易的传代。这些细胞倾向于紧密粘附于组织培养处理的细胞和烧瓶难以解除后续实验。
Transwell设置
1. BMM和PC3细胞应当在70-80％汇合，并且可以在同一天使用
2. BMM：
  1. 取出介质，用1x PBS轻轻冲洗BMM培养皿。加入〜8ml 新鲜的BMM培养基，并使用无菌细尖轻轻取出细胞移液管和细胞刮刀，收集到15ml离心机中管
  2. 对单细胞悬液进行细胞计数，并且板中的0.35×10 6个BMM在2ml的BMM培养基中直接在6孔中板。
3. 使用无菌镊子，轻轻地放置transwell插入在新铺板的细胞上方的每个孔中。通过他们的设计插入通过井的壁固定就位。他们将保持暂停并触摸媒体，但不是板的底部允许自由在底部和顶部的细胞之间交换可溶性因子插入。
4. PC3s
  1. 使PC3细胞在T75烧瓶中生长至〜70-80％汇合。
  2. 用1×无菌PBS冲洗，并使用2ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA解离细胞
  3. 使用8毫升完整的DMEM停止胰蛋白酶的活动，收集所有10毫升在15毫升离心管。
  4. 在130×g离心细胞5分钟，在RT下沉淀，和重悬于适量的完全DMEM（〜8ml）中以进行a 细胞计数。
  5. 板0.2×10 6 PC3s在2ml完全DMEM中的transwell插入物的顶部。
5. 让细胞在细胞培养箱中不受干扰地生长48小时
6. 当对没有transwell的对照条件进行电镀时，相同数量的细胞直接在6孔板上，在2ml的混合物中完全DMEM和2ml BMM培养基。
改变共培养至无血清条件（如有必要）
1. 对于需要分析由细胞调节的培养基的实验共培养和避免介质中的血清干扰，transwell 共培养可以在之前12-16小时改变为无血清条件收获
2. 简言之，48小时后，用1x轻轻地洗涤细胞3次无菌PBS。为此，请从transwell顶部取出介质，提起 transwell，从孔底部除去培养基，加入2ml PBS 到孔底部，更换transwell，加入2ml PBS transwell，轻轻搅拌。重复至少2次。
3. 板2毫升无血清MEM-α到底部的孔，和2毫升的无血清DMEM至transwell。让细胞静置12-16小时在细胞培养箱中不受干扰
4. 如果改为无血清条件不是必需的，应进行3x PBS洗涤紧接在样品收获之前用于分析。
收获实验蛋白样品
1. 媒体：
  1. 将培养基收集到15ml离心管中。将任何transwell转移到新的，未使用的6孔培养皿
  2. 通过在4℃下离心收集的培养基（130×g）（以保持细胞完整）5分钟，除去任何浮游细胞。
  3. 将培养基转移到新的15 ml离心管中
  4. 通过在830 x g离心10分钟，去除任何额外的细胞碎片 min。有必要单独执行两个自旋并且在进行830×g 旋转之前去除完整的细胞
  5. 冷冻介质在-80°C收集以备将来使用，或者如果需要，使用5 K Millipore离心浓缩器浓缩。
  6. 将培养基转移到浓缩器，并在4℃下以3,000×g转动，直到达到所需的体积。
  7. 将浓缩培养基储存于-80℃备用。
2. 蛋白裂解物 - BMM
  1. 收集培养基后，向细胞中加入所需量的SME（〜200μl），置于冰上。
  2. 轻轻刮取细胞，收集到1.5 ml管中
  3. 在-80℃冷冻。
3. 蛋白裂解物 - PC3s
  1. 收集培养基后，向转孔中加入2ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA，和1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA加到用作对照的孔中（即直接在孔上）塑料）。
  2. 在37℃下〜5分钟后，细胞应解离。停止用4ml完全DMEM的胰蛋白酶化。这个卷是足以控制井
  3. 使用无菌细尖转移移液，轻轻冲洗和收集细胞从孔中进入15毫升离心管。对于transwells，添加另外4毫升完整 DMEM至transwell，并再次冲洗，添加额外的培养基原管。
  4. 在室温下以130×g离心细胞5分钟。
  5. 取出培养基，轻轻地清洗沉淀，重悬在〜10毫升1×无菌PBS
  6. 在室温下将细胞在130×g下旋转5分钟，并除去所有PBS
  7. 将沉淀重悬在SME（约200μl）中，并转移到1.5ml管中
  8. 在-80℃下冷冻。
收集样品进行RNA分析
1. 48小时后，如步骤C1中所述轻轻地用PBS洗涤细胞1次。
2. 收集PC3细胞，如步骤D3a-d所示。洗涤丸用PBS附加时间（重复步骤D3e-f另外的时间）。加从RNeasy Plus迷你试剂盒的RLT缓冲液到沉淀。每孔使用〜250μl 集。转移到新鲜QIAshredder。
3. 每孔加入约250μlRLT缓冲液，直接冲洗BMM细胞。刮细胞并收集到新鲜的QIAshredder
4. 按照RNeasy Plus Mini Kit提供的说明进行RNA提取

食谱

完成DMEM
445ml DMEM，无菌过滤
50ml热灭活的胎牛血清 5ml青霉素 - 链霉素10,000U/ml/ml
L929条件培养基
1. L929细胞在完全DMEM中使用100mm组织培养皿在48小时内在10ml中生长至〜70-80％汇合。
2. 将细胞收集到15ml离心管中
3. 通过在130×g离心5分钟从培养基中除去细胞
4. 将培养基转移到新的15ml离心管中
5. 通过在830×g离心10分钟从培养基中除去细胞碎片
6. 将培养基转移到新的15ml离心管中并使用
BMM培养基（30％L929 CM; 20％FBS）
12 ml L929条件培养基
5.3ml热灭活的胎牛血清 22.7ml MEM-α培养基
SME裂解缓冲液
250mM蔗糖 25 mM MES
1mM EDTA
在去离子水中
pH至6.5，使用前加入0.1％TritonX-100

致谢

这个协议改编自我们的手稿Herroon et al。（2013）。 Grant支持由DOD PC074031，DOD PC030325，Wayne State University启动基金和MICR：P30 CA 22453提供。

参考文献

Herroon，M.K.，Rajagurubandara，E.，Rudy，D.L.，Chalasani，A.，Hardaway，A.L.and Podgorski，I.（2013）。巨噬细胞组织蛋白酶K促进骨中的前列腺肿瘤进展癌基因 32（12）：1580-1593。