材料和试剂

PEPCK活性
1. 未收割的植物组织（如何冻结组织在程序部分解释）
2. 液体N <2>
3. 冰块
4. Bicine（Sigma-Aldrich，目录号：B8660）
5. KOH
6. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-100G）
7. 聚（乙二醇）-4000（Sigma-Aldrich，目录号：81240）
8. 二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
9. β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型（NADH）（Roche Diagnostics，目录号：10128015001）
10. 4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸，N-（2-羟乙基）哌嗪-N' - （2-乙磺酸）（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
11. KCl
12. MnCl 2
13. 磷酸芘酯（PEP）（Bio Vectra，目录号：2552）
14. 腺苷5'-二磷酸钠盐（ADP）（Sigma-Aldrich，目录号：A2754）
15. KHCO ₃
16. L-苹果酸脱氢酶（Roche Diagnostics，目录号：10127248001）
17. Bradford储液（Bio-Rad Laboratories，目录号，500-0006）
18. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
19. 提取缓冲液1（参见配方）
20. 提取缓冲液2（参见配方）
21. 缓冲区3（参见配方）
22. PEPCK测定混合1（参见配方）
NADP-ME活性
1. 未收割的植物组织（如何冻结组织在程序部分解释）
2. 液体N <2>
3. 冰块
4. Tris-Base（United States Biological，目录号：T8600）
5. MnCl 2
6. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-100G）
7. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
8. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
9. β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP ⁺）（Roche Diagnostics，目录号：10128058001）
10. L-苹果酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：M1000）
11. Bradford储液（Bio-Rad Laboratories，目录号，500-0006）
12. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
13. 提取缓冲液4（参见配方）
14. NADP-ME测定混合物1（参见配方）

设备

小砂浆和杵
2 ml和1.5 ml微量离心管
移液器
余额
2ml离心机（Hettich Mikro 22R）
96孔聚苯乙烯微板（平底）（Corning，目录号：3300）
计算机支持的用于动力学（时间过程）测量模式的微孔板分光光度计（Elisa微孔板 - 分光光度计）（BioTek Instruments，型号：EL808）

程序

提取测量PEPCK活性
该协议适用于从植物组织中提取PEPCK
1. 收集样品并立即在液体N 2中冷冻。储存于-80℃直至使用。
2. 将少量液体N 2和冷冻样品加入研钵中。研磨组织直到样品是细粉末。小心地加入更多的液体N <2>如果需要保持冷冻
3. 将500mg组织重量500mg装入微量离心管中并加入900μl提取缓冲液1（EB1）（对于果实组织，动力组织/EB的比例为1:1.8，w/v），该比例可能需要增加至1:3 对于叶组织）
4. 在准备所有样品的同时保持在冰上，并涡旋30秒
5. 在4℃和13,000×g离心15分钟。删除500微升上清液（澄清的提取物）到一个新鲜的微量离心管，加入850微升提取缓冲液2（EB2），使最终浓度为35％的PEG（混合良好）。
6. 在冰上孵育10分钟，并在13,000×g离心20分钟。弃去上清液。
7. 重悬浮在100微升缓冲液3（B3），并保持在冰上的沉淀。立即测量PEPCK活性或可将澄清提取物的等分试样快速冷冻在液体N 2中并储存在-80℃以备将来使用。
PEPCK活动
PEPCK的活性通过在25℃下在340nm下NADH的氧化后在羧化方向上测量。简言之，使用连续测定法，其中由PEPCK产生的OAA立即还原成苹果酸盐，并且这通过包含苹果酸脱氢酶来实现。使用分光光度计在340nm下测量苹果酸脱氢酶对NADH的氧化
1. 准确吸取2-10μl澄清的提取物到微孔板孔中
2. 使用重复移液器添加150μlPEPCK测定混合1每个孔，立即放置在微孔板分光光度计。连续监测NADH氧化为NAD ⁺，作为在340nm（A 340）的吸光度的下降，每5-10秒读取最多5分钟（样品需要在阅读时震动）。
3. 通过从反应混合物中省略PEP来校正背景NADH氧化。确保A 340（NADH被氧化的量;ε340 = 6,220/M/cm）的下降与测定时间和测定的酶浓度成比例。对于含有丰富的PEPCK活性的样品，澄清提取物在提取缓冲液中的稀释可能是必需的。
  注意：酶活性的一个国际单位（U）定义为在25℃下每分钟产生1μmol产物的酶量。 PEPCK活性（U/ml澄清提取物）=（ΔA/340×min /澄清提取物稀释因子）/6.22。因此，如果3.0μl澄清的提取物与150μlPEPCK反应混合物混合，则在340nm下产生0.2的ΔAinf 340 340，这样，在340nm处的ΔA<340> PEPCK活性=（0.2×50）/6.22U/ml = 1.6U/ml。
测量NADP-ME活性的提取
该协议适用于从植物组织中提取NADP-ME
1. 收集样品并立即在液体N 2中冷冻。储存于-80℃直至使用。
2. 将少量液体N 2和冷冻样品加入研钵中。研磨组织直到样品是细粉末。小心地加入更多的液体N <2>如果需要保持冷冻
3. 重量将100mg组织放入微量离心管中并加入200μl提取缓冲液4（EB4）（对于果实组织，动力组织/EB的比例为1:2，w/v），该比例可能需要增加至1:3对于叶组织）
4. 在准备所有样品的同时保持在冰上，并涡旋30秒
5. 在4℃和13,000×g离心10分钟。转移上清液到一个新鲜的微量离心管。立即测量NADP-ME活性或者可以将澄清的提取物的等分试样快速冷冻在液体N 2中并储存在-80℃以备将来使用。
NADP-ME活动
NADP-ME的活性基于在340nm下在25℃下NADP +的还原。简言之，使用连续测定法，其中将苹果酸盐氧化成丙酮酸盐和CO 2 2，并将NADP +还原成NADPH。使用分光光度计在340nm测量NADP-ME对NADP ⁺的还原。
1. 准确吸取5-10微升澄清的提取物到微孔板孔
2. 使用重复移液器添加100微升NADP-ME测定混合1到每个孔，并立即放置在微孔板分光光度计。作为在340nm处的吸光度的增加（A 340），连续监测NADP +还原为NADPH，每5-10秒读取读数直到5分钟（样品需要在阅读时震动）。
3. 通过从反应混合物中省略L-苹果酸盐来校正背景NADP ⁺还原。确保A 340的增加与测定的酶的测定时间和浓度成比例。对于含有丰富的NADP-ME活性的样品，澄清提取物在提取缓冲液中的稀释可能是必需的。
  注意：酶活性的一个国际单位（U）定义为催化形成1μmolNADPH/min 的酶的量。在指定的条件下。 NADP-ME活性（U/ml 澄清的提取物）=（ΔA /min x澄清的提取物稀释因子）/6.22。因此，如果2.0μl澄清的提取物与100μlNADP-ME反应混合物混合，在340nm处产生1.5的ΔA<340> /min ，则NADP-ME活性=（1.5×50）/6.22U/ml = 12.5U/ml。

Bradford蛋白浓度测定

对于制备BSA标准曲线：
制备1ml 10mg BSA/200ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）的储备溶液，并使用以下模板制备重复的标准曲线：

最终浓度（ng /μl）	Vol。（μl）BSA原液（0.05mg/ml）	PBS（μl）	μg蛋白/孔
0	0	200	0
6.25	25	175	1.25
12.5	50	150	2.5
18.7	75	125	3.75
25.0	100	100	5

每孔加入50μl等分试样上清液（或其稀释液）或BSA标准品
加入130μl布氏原液（见材料和试剂部分），先前溶于蒸馏水（稀释1/5）。
短暂摇动，等待5分钟。测定595nm处的OD。使用从校准中获得的斜率和空白来确定每种提取物中的蛋白质浓度

食谱

提取缓冲液1（EB1，保存在冰上）
500mM N-二甘氨酸-KOH（pH9.0） 200 mM KCl
3 mM EDTA
5％（w/v）PEG-4000
25 mM DTT（每次使用前都要新鲜加入）
0.4％BSA
提取缓冲液2（EB 2，保存在冰上）
500mM N-二甘氨酸-KOH（pH9.0） 3 mM EDTA
55％（w/v）PEG-4000
25 mM DTT（每次使用前都要新鲜加入）
缓冲液3（EB3，保存在冰上）
10mM Bicine-KOH（pH9.0） 25 mM DTT（每次使用前都要新鲜加入）
注意：没有DTT的EB1，EB2和EB3可以在4ºC保存几周。
PEPCK测定混合1
100mM Hepes-KOH（pH 6.8）
100 mM KCl
0.14mM NADH
25 mM DTT（每次使用前都要新鲜加入）
6mM MnCl 2
6 mM PEP
1 mM ADP
90mM KHCO 3
6U ml 苹果酸脱氢酶
提取缓冲液4（EB4，保存在冰上）
100mM Tris-HCl（pH8.0） 5mM MgCl 2/
2mM EDTA 10％（v/v）甘油 10mM 2-巯基乙醇
NADP-ME测定混合物1（保存在冰上）
50mM Tris-HCl（pH8.0）
10mM MgCl 2/
0.5 mM NADP ⁺
10mM L-苹果酸盐

致谢

我们承认Helga Kulka（Max-Planck-InstitutfürMolekulare Planzenphysiologie）和Hanna Levanony（Weizmann Institute of Science）对植物的优良护理。该协议改编自Osorio等人（2013）。

参考文献

Centeno，DC，Osorio，S.，Nunes-Nesi，A.，Bertolo，AL，Carneiro，RT，Araujo，WL，Steinhauser，MC，Michalska，J.，Rohrmann，J.，Geigenberger，，Stitt，M.，Carrari，F.，Rose，JKand Fernie，AR（2011）。苹果酸在番茄果实的淀粉代谢，成熟和可溶性固体含量中起着至关重要的作用，并影响采后植物细胞 23（1）：162-184。
Osorio，S.，Vallarino，J.G。，Szecowka，M.，Ufaz，S.，Tzin，V.，Angelovici，R.，Galili，G.and Fernie，A.R。在成熟番茄果实的质体或细胞溶质中改变丙酮酸和苹果酸的相互作用引起了不同的后果糖但对细胞有机酸，代谢和瞬时淀粉积累的相似作用。植物生理学161（2）：628-643。