材料和试剂

Neuro2a细胞（N2a）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378-500G）
1 M Tris-HCl（pH 7.1）
0.5M EDTA（Millipore，目录号：324503-1KG）
纯化水
100mg/ml环己酰亚胺在DMSO中的溶液（Sigma-Aldrich，目录号：C4859-1ML）
完全蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：04693116001）
补充有10％胎牛血清的OptiMEM I
不含钙/镁的磷酸盐缓冲液（Ca/Mg）（Life Technologies，目录号：10010-023）
脱氧胆酸（Sigma-Aldrich，目录号：D2510-100G）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：93443-100ML）
十二烷基硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：L6026-50G）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G9012-500ML）
磷酸盐缓冲的0.5％Triton X-100（TX100）/0.5%脱氧胆酸盐（DOC）裂解缓冲液（参见配方）
5x样品缓冲液（见配方）

设备

6孔板
1ml BD Luer-Lok一次性注射器（BD，目录号：309628）
25G超薄壁针（Terumo Medical Corporation，目录号：NN-2525R）
细胞刮刀
离心管（薄壁，Ultra-Clear TM，5ml，13×51mm）（Beckman Coulter，目录号：344057）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：L8-80M）
预冷的摇臂转子（Beckman Coulter，型号：SW50.1）
便携式折射计（可选）（如 ATAGO，型号：PAL-1）
倒置显微镜

程序

蔗糖和匀浆缓冲液的制备
1. 决定阶梯梯度的层的蔗糖浓度，例如36％，33％和8.5％（Taguchi等人，2013）。
2. 蔗糖缓冲液的浓度基于"重量百分比"，即蔗糖浓度（％）= 100×蔗糖（g）/[蔗糖（g）+水（G）]。
3. 然后，取需要量的蔗糖并溶解在纯水中。通常，测量实际浓度不是只要蔗糖和水的量是正确的。如果必要的，我们用便携式确认实际浓度折射计。
4. 在制备蔗糖溶液后，水，我们测量体积并加入1/250体积的1M Tris-HCl（pH 7.1），使最终浓度为4mM。我们使用Tris-HCl缓冲液缓冲器类型应基于以下过程来确定和实验的目的
5. 用于均化缓冲液，匀浆缓冲液的蔗糖浓度为8.5％并且，除了4mM Tris-HCl，我们添加EDTA至最终浓度2mM，环己酰亚胺至30μg/ml，以及完全蛋白酶抑制剂混合物，根据制造商的剂量指令。加入环己酰亚胺以保持多核糖体内质网和增加细胞器的密度更有效的分离（de Araujo et al。，2007）。
细胞的均质化
1. 冲洗N2a细胞，100％汇合在OptiMEM I中补充10％胎牛血清在6孔板的孔中，一次用预冷冻 PBS，不含Ca/Mg，然后加入700μl的3mM EDTA的PBS溶液，几分钟，直到细胞可以容易地从底部分离移液。
  1. 虽然N2a细胞可以用这个程序分离，更多的粘性细胞可能需要用细胞刮刀机械解开。上的另一方面，较少粘附的细胞可能不需要PBS中的EDTA 分离。
  2. 彻底分离细胞并转移细胞在PBS中倒入预冷的1.5ml管中。然后，冲洗底部孔与500μl的3mM EDTA的PBS溶液，并将其加入到试管中。
  3. 保持细胞和管总是在冰上。
2. 在4℃下将细胞悬浮液以200×g离心5分钟，然后小心地除去上清液。在4-7中重悬沉淀的细胞体积的匀浆缓冲液。来自6孔的一个孔的细胞板，我们通常加入200μl匀浆缓冲液。
3. （可选）均质前，取10μl细胞悬液全细胞裂解物分析并与30μl磷酸盐缓冲的0.5％ Triton X-100/0.5％脱氧胆酸盐裂解缓冲液。
  1. 在冰上孵育10分钟后，离心沉淀细胞碎片，并小心地将上清液作为全细胞裂解物吸出。
  2. 加入10μl的5x样品缓冲液，煮沸10分钟，以制备"全细胞裂解液"样品，无需分馏。
4. 通过通过25G使其余的细胞均匀化超薄壁针头连接到1ml注射器直到〜90％的细胞被打乱。细胞破坏的程度对于产量是至关重要的的细胞器和蛋白质连接到它们，这一步必须仔细评估。
  1. 首先，检查单元格的状态建议每10〜15次。这是通过取1-2μl 的匀浆并将其悬浮在a的盖子上的一滴PBS中并在倒置显微镜上观察。完全裸观察到从破碎的细胞释放的核相对平坦和小圆形结构，而未破坏的细胞明显较大和较为球形。
  2. 多少笔画细胞充分分裂所必需的细胞可以在细胞之间变化类型。例如，我们使用的单元格需要超过30行程。
  3. 作为注意事项，在均质化程序中应避免产生气泡。
5. 细胞充分崩解后，离心匀浆在2,000×g下在4℃温育5分钟。小心取上清液 "后核分数"，并通过标记水平估计体积在移液管尖端中匀浆并测量水的体积填补到标记。
  1. 加入1.4体积的62％蔗糖缓冲液，充分混合直至混合物变得完全均匀。作为两个溶液不容易混合，轻轻地用a。轻轻吹打混合 '基因组尖端'（或具有尖端截止的移液管尖端）并与之搅拌尖端同时到移液不能"清除的点条纹"（de Araujo et al。，2007）。
  2. 保持后核分数冷冻整个程序。
6. 将后核部分与62％蔗糖缓冲液混合底部并用三层蔗糖覆盖溶液，例如36％，33％，最后是匀浆缓冲液（8.5％），1.5 ml，从底部到顶部（Taguchi等人，2013）。
  1. 小心倒入蔗糖缓冲液不要搅拌太多的界面。倾斜管，将移液管尖端的点放在表面的上方下层在管中并小心地推出溶液在尖端让它慢慢地沿着墙壁浮动
  2. 间隔接口应足够远，以避免相邻的污染在收获过程中的界面浓缩细胞器。
  3. 作为层的最佳蔗糖浓度用于分离感兴趣的细胞器似乎在细胞之间变化线，修改蔗糖浓度的组合根据细胞器标记蛋白的分布直到最合适组合。
7. 超离心机梯度为40,000 rpm在4℃下1.5小时。我们使用了Beckman SW50.1摆动转子和a Beckman L8-80M超速离心机。
8. 超速离心后，分馏的细胞器在层之间凝聚并且可见 "乳白色"带（图1）。作为样品该图是从100mm皿制备的，"乳白色"带是更清晰可见。使N2a细胞在6孔的孔上汇合板，带是可见的，但不太明显。吸引"乳白色带"尽可能彻底，这需要扫描移液管尖，逐渐吸入，在接口的白色带上，直到它完全收集。我们通常需要更多的音量，以便我们可以最有效地回收所需的细胞器，例如350μl。
  
  图 1.分步梯度中分级细胞器的外观的实例分馏。样品来自100毫米细胞培养皿和四个层覆盖在匀浆上。注意有四个 "乳白色"带在五层的界面
9. 如果目的只是评估特定蛋白质的分布我们通常稀释收集的界面与300μl含有30μg牛血清白蛋白作为载体的PBS 蛋白质，然后进行甲醇/氯仿沉淀（Taguchi et al。，2013）。将蛋白溶解在1×样品缓冲液中煮沸10分钟以制备"分馏的"样品。

食谱

磷酸盐缓冲的0.5％Triton X-100（TX100）/0.5%脱氧胆酸盐（DOC）裂解缓冲液
1. 首先准备5％TX100/DOC储备溶液
  
  Triton X-100
  5 ml
  
  脱氧胆酸
  5克
  
  纯化水
  最多100 ml
2. 然后在50ml锥形管中混合5％TX100/5％DOC，10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）和水
  
  5％TX100/5％DOC
  5 ml
  
  10x PBS
  5 ml
  
  纯净水
  最多50 ml

5x样品缓冲液

SDS	1.2克
1 M Tris-HCl（pH7.1）	2.5 ml
甘油	4 ml
0.5％BPB	300-500微升
水	最多10 ml

致谢

该协议改编自Taguchi等人（2013）。这项工作是由国家卫生研究所R01 NS076853-01A1和艾伯塔朊病毒研究所（AB，加拿大）的拨款支持。

参考文献

de Araujo，M.E。和Huber，L.A。（2007）。亚细胞分级分离 Methods Mol Biol 357：73- 85.
Taguchi，Y.，Mistica，A.M.，Kitamoto，T.andSchätzl，H.M。（2013）。螺旋1和2之间的区域对于转化无能朊病毒的有效显性 - 阴性抑制的关键意义蛋白质。 PLoS Pathog 9（6）：e1003466。