第I部分。用碘染色法定性检测细胞内糖原

材料和试剂

L。嗜酸菌菌株或所需的细菌菌株
MRS肉汤（Difco）或其他选择的液体生长培养基（在4℃下保存）
碘溶液（见配方）
含有2％（w/v）碳水化合物的固体半定义培养基（SDM）（参见配方）

设备

37℃孵育器
37℃厌氧培养箱
Pipettor

程序

接种 L。嗜酸乳杆菌菌株在5ml MRS肉汤中感兴趣并在37℃下在无氧或环境大气条件下生长过夜。
转移和点5到8微升的每个过夜培养物在固体琼脂生长培养基（我们使用固体SDM补充2％海藻糖或葡萄糖）。如果可能，包括阳性和/或阴性对照菌株可选：斑点板可以多次重复制备，以提供多次碘染色试验（见步骤4-6）。
让点样的培养物吸收到琼脂培养基中，并在37℃厌氧培养板36-48小时，直到菌落可见。
小心地将5ml新鲜制备的碘溶液（0.01M I 2，0.03M KI）转移到具有生长的集落的琼脂板上。
在室温下用碘溶液孵育细胞30秒至1分钟
立即用移液器从板中除去碘溶液。含有细胞内糖原的细胞会染成褐色;而缺乏胞内糖原的细胞将呈现黄色或无色任选：为了增强用于捕获染色菌落图像的显色，可以将染色板（在除去碘溶液后）在黑暗中孵育另外10分钟。
注意：来自碘溶液的染色剂不是永久性的，并且在约30分钟至1小时后将逐渐消失。

代表数据

实施例：嗜酸性粒细胞 NCFM和用碘溶液染色的糖原代谢突变体

图1. l的碘染色。嗜酸性亲本菌株（NCK1909）和在含有2％海藻糖的固体SDM上生长的同基因糖原代谢突变体。糖原合成途径的缺失突变体Δg1ggA和Δg1ggβ显示为黄色/无色（ - ），表明糖原缺乏表型。与亲本菌株一样，糖原降解途径的Δemggp和Δamy突变体染色为棕色（+），表明它们合成细胞内糖原的能力不受影响。 glgA ，糖原合酶基因; glgB ，分支酶基因; glgP ，糖原磷酸化酶基因和amy ，假定的α-淀粉酶/脱支酶基因。 Figure from Goh and Klaenhammer（2013） size：10.0pt; line-height：115％; font-family："">。

食谱

碘溶液
0.01 M I <2>
0.03 M KI
在每次实验前准备新鲜的
保持阴暗
半定义介质（SDM;修改自参考文献3）
吐温80（1g/L）柠檬酸铵（2g/L）
醋酸钠（5g/L）
MgSO 4·7H 2 O（0.1g/L）。< br /> MnSO 4（0.05g/L）
HPO <4>（2g/L）酵母氮基（5g/L）
中腹（10克/升）
碳水化合物底物，例如葡萄糖或海藻糖，2％（或期望的）最终浓度。
注意：对于海藻糖或任何热不稳定的糖，准备25-40％（w/v）储备溶液，过滤灭菌，并向高压灭菌的SDM添加适当体积至最终浓度为2％。对于溶解性差的碳水化合物。棉子糖，将2％（w/v）的糖直接加入SDM（无菌或未灭菌）中，搅拌以溶解，并通过0.45μm过滤器过滤灭菌。对于固体培养基，加入琼脂，15 g/L
通过高压灭菌或用0.45μm过滤器过滤灭菌（见上文;仅用于肉汤）
储存在4°C

第二部分。细胞内糖原的定量测量

材料和试剂

L。嗜酸杆菌菌株（或其他细菌菌株）
MRS肉汤（储存在4℃）
磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）（例如Life Technologies，目录号：10010-023）
0.25M Na 2 CO 3溶液（用0.45μm过滤器过滤灭菌）
1M乙酸
0.2M乙酸钠（pH5.2）（用0.45μm过滤器过滤灭菌）
无菌蒸馏水
淀粉葡糖苷酶（10mg/ml，≈0.14U/μl）（Roche Diagnostics，目录号：10102857001）（保存在4℃）
葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖测定试剂）（Sigma-Aldrich，目录号：G3293）（保存在4℃）
糖原（5-20mg/ml溶液）（例如Life Technologies，目录号AM9510）（储存在-20℃）
具有2％（w/v）碳水化合物底物（参见Recipes）（或选择的液体生长培养基）的SDM肉汤

设备

37℃孵育器
离心（适用于15ml和50ml管; 1,717×g ）
微量离心机（14,549 x g ）
Pipettor
一次性锥形离心管（15 ml和50 ml）
1.5ml螺旋盖管（无菌）（例如Thermo Fisher Scientific，目录号：02-681-343和02-681-368）（在使用前具有盖的高压灭菌管）
1.5 ml微量离心管（无菌）
分析天平
涡流
热板
大玻璃烧杯（例如1000ml Pyrex玻璃烧杯）
微型离心管浮动架（圆形，适合大型玻璃烧杯）
温度计
在配有搅拌器（或杂交炉）的57℃的孵育器
分光光度计或微量滴定板读数器（能够测量340nm处的吸光度）

程序

培养 L。在含有2％（w/v）碳水化合物底物（我们补充了已知诱导糖原生物合成的碳水化合物底物）的SDM肉汤中在37℃下培养至期望的生长期的嗜酸乳杆菌细胞， xg，10分钟，室温）。细胞沉淀可以在离心后立即加工或储存在-80℃ 注意：
1. 一般来说，对于早期记录（OD 0.3到0.4），中期日志（OD 〜 0.6），静止（OD 〜 <1.0> 1.6）和后期稳定期培养物（OD 〜 <2.0）收获等分试样。 50ml，30ml，20ml和15ml 一次性锥形离心管， 0.04〜0.06g的细胞湿重。
2. 我们准备培养物和细胞沉淀代表至少两个生物学重复以证明实验结果的重现性。
预标签，预称重（带盖），并为每个样品指定每个1.5 ml螺旋盖管。
将每个细胞沉淀重悬于1ml PBS中，并转移至指定的预称重的1.5ml螺旋管
离心（14,549×g，1分钟，室温），用移液器除去所有上清液。
重复步骤4离心至少两次以去除所有上清液，以获得准确的细胞湿重
用细胞团称重管（带盖）。从重量值中减去空管（有盖;来自上述步骤2）的先前重量，以获得净细胞湿重。
向细胞沉淀中加入0.25ml的0.25M Na 2 CO 3溶液。通过温和涡旋重悬。
注意：不要使用移液器重悬细胞沉淀，因为任何数量的细胞粘附在移液管尖端会改变净细胞湿重。
对于控制：包括2个额外的管（无需预先称重）。在每个管中，加入约400μg（例如20μl的20mg/ml）糖原至0.25ml的0.25M Na 2 CO 3 sub >解决方案。按照步骤8-12。
孵育细胞悬浮液在95至98℃下4小时（我们将管安全地放置在微量离心管浮动架，并在一个大的烧杯水在热板上加热孵化。在4小时孵育期间轻轻涡旋混合细胞悬液1至2次
向细胞悬浮液中加入0.15ml 1M乙酸和0.6ml 0.2M乙酸钠（pH5.2），使pH为〜5.2，最终体积为1ml。
向细胞悬浮液（1.4 U/ml的淀粉葡糖苷酶终浓度）中加入10μl淀粉葡糖苷酶（0.14 U /μl）。
对于对照：向含有400μg糖原的两个对照管（参见步骤7）中，向其中一管（标记为阳性对照）和10μl无菌蒸馏水中加入10μl淀粉葡糖苷酶（标记为阴性对照）。
孵育管在57°C过夜，持续搅拌（我们用石蜡膜密封管，并在杂交炉中孵育管）。
第二天，离心细胞悬浮液（5,000x g，3分钟，室温）以沉淀细胞碎片。
使用己糖激酶/基于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的葡萄糖测定试剂盒根据制造商的说明书测量从细胞内糖原释放的葡萄糖。
使用所得葡萄糖浓度（1ml来自步骤9的样品中的葡萄糖的mg）来计算每g细胞湿重的细胞内糖原含量（表示为每g细胞湿重的mg葡萄糖）。

代表数据

实施例：定量测定细胞内糖原含量。嗜酸性亲本菌株（NCK1909）和同基因糖原代谢突变体

图2.在含有2％海藻糖的SDM中生长的对数期中期细胞的细胞内糖原含量。在该定量测定中，从ΔggAΔ和Δ< em> glgB 突变体。这证实了定性检测的结果测定方法（图1）。数据显示代表两个独立生物学的平均值±标准偏差复制。图改编自Goh等人。（2003）。

食谱

半定义培养基[（SDM;从Kimmel和Roberts（1998）修改]
吐温80（1g/L）柠檬酸铵（2g/L）
醋酸钠（5g/L）
MgSO 4·7H 2 O（0.1g/L）。< br /> MnSO 4（0.05g/L）
HPO 4（2g/L）酵母氮基（5g/L）
中腹（10克/升）
碳水化合物底物，例如葡萄糖或海藻糖，2％（或期望的）最终浓度。
注意：对于海藻糖或任何热不稳定的糖，准备25-40％（w/v）储备溶液，过滤灭菌，并向高压灭菌的SDM添加适当体积至最终浓度为2％。对于溶解性差的碳水化合物。棉子糖，将2％（w/v）的糖直接加入SDM（无菌或未灭菌）中，搅拌以溶解，并通过0.45μm过滤器过滤灭菌。对于固体培养基，加入琼脂，15 g/L
通过高压灭菌或用0.45μm过滤器过滤灭菌（见上文;仅用于肉汤）
储存在4°C

致谢

所述方案在Goh和Klaenhammer（2013）中公开，并且基于来自Govons等人的先前作品（1969），Kimmel和Roberts（1998），Law& al。（1995），和Parrou and Francois（1997）。这项工作的资金来源包括丹尼斯克/杜邦营养与健康和北卡罗来纳农业基金会。

参考文献

Goh，Y. J.和Klaenhammer，T. R.（2013）。嗜酸乳杆菌中的功能性糖原生物合成途径：表达和分析 glg 操纵子。 Mol Microbiol 89（6）：1187-1200。
Govons，S.，Vinopal，R.，Ingraham，J。和Preiss，J.（1969）。大肠杆菌突变体的分离 b在合成糖原的能力上有所改变。

97（2）：970-972。
Kimmel，S.A。和Roberts，R.F。（1998）。开发适合于德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）ssp的胞外多糖生产的生长培养基。 bulgaricus RR。 Int J Food Microbiol 40（1-2）：87-92。
Law，J.，Buist，G.，Haandrikman，A.，Kok，J.，Venema，G。和Leenhouts，K。（1995）。在乳酸乳球菌中产生染色体突变的系统，它允许快速分析靶向基因。细菌 177（24）：7011-7018。
Parrou，J.L.and Francois，J。（1997）。在整个酵母细胞中快速可靠地测定糖原和海藻糖的简化程序。 a> Anal Biochem 248（1）：186-188