材料和试剂

IMDM（粉末或液体）
马血清（HS）（如果细胞存活率低，可能需要批次测试）
胎牛血清（FBS）
L-谷氨酰胺
青霉素/链霉素（P/S）
SCF条件培养基（SCF-CM）（见注释）
重组人促红细胞生成素（例如，epoietin alpha，Amgen）（通过医院药房在适当的本地指导下获得）
重组小鼠白细胞介素-3（IL-3）（例如Pepro Tech，目录号：213-13）
重组小鼠粒细胞 - 单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）（例如Pepro Tech，目录号：315-03）
全反式视黄酸（ATRA）（例如Sigma-Aldrich，目录号：302-79-4，在乙醇中重建）
文化补充剂和抗生素（L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素）
用于流式细胞术的单克隆抗小鼠抗体
1. C-kit/CD117（克隆2B8）（例如PE-Cy7，eBioscience，目录号：25-1171）（建议以1:100稀释使用）
2. CD34（克隆RAM34）（例如Alexa-Fluor 647，eBioscience，目录号：51-0341）（建议以1:100稀释使用）
3. Mac-1/CD11b（克隆M1/70）（例如PE，eBioscience，目录号：12-0112）（建议以1:100稀释使用）
4. Gr1/Ly6C（克隆RB6-8C5）（例如FITC，eBioscience，目录号：11-5931）（建议以1:100稀释使用）
5. Sca-1/Ly6A/E（克隆D7）（例如Pacific blue，BioLegend，目录号：122520）（建议以1:50稀释使用）
  注意：在冰上，在培养基中，染色20分钟; 用10-20倍体积的洗涤中; 沉淀细胞在400×g离心5分钟。重悬在300-500μl的介质用于FACS分析
台盼蓝

设备

具有过滤盖（用于生产条件培养基）的T175组织培养瓶
T75或T25组织培养瓶中，过滤的盖或6孔板注意：对于EML培养物，组织培养瓶的尺寸由在方案中指示的细胞密度下接种的细胞数确定。
细胞培养孵化器

程序

维持培养条件
1. EML细胞维持培养条件是具有5％HS，2mM的IMDM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素（P/S）和10-15％ SCF条件培养基（SCF-CM）。
  注意：将EML细胞的原始品种在补充的培养基中生长与大鼠SCF的最终浓度为200ng/ml（Tsai等，1994）。
2. 细胞应以2×10 4个细胞/ml接种，并分开至初始当细胞密度为10 5 s -1 x 10 -5 s/ml（绝对最大值）时的稀释度为到达。这通常意味着每2或分裂文化有时3天。培养物在更高的细胞密度下快速死亡。
  注意：维持培养中的死细胞分数，由台盼判断蓝色排除，不应超过5-8％（如果不是10％是可以接受的表示培养物耗尽趋势。
3. 培养物可以在解冻后保持至少20代，而生物学没有任何显着变化。
红细胞分化条件
1. 使用来自维持培养的对数生长期的EML细胞，并以2×10 4个细胞/ml的接种浓度接种它们维持培养基+重组人促红细胞生成素（EPO）最终浓度为10U/ml
2. EML红系分化文化对细胞拥挤非常敏感，所以选择增加培养体积而不是初始细胞密度，如果大量需要单元格。
3. 文化2天。之后这个初始期间，在含有5％HS + 2mM L-谷氨酰胺和1x的IMDM中洗涤细胞2-3x P/S，并以2×10 4个细胞/ml在IMDM，5％HS，2mM L-谷氨酰胺和1x P/S，具有2.5％SCF-CM和10U/ml EPO。
4. 区分细胞共7天（因此，另外5天），用新鲜的EPO（10 U/ml）在第5天加入到现有培养物中
5. 预期观察培养期间细胞数量的平均20倍扩增期间，细胞活力随细胞逐渐减少分化，在第7天至少为40-50％。
6. 程度细胞分化可以通过流式细胞术染色来确定 C-Kit，Sca1和CD34，具有分化的积累 Sca1 -/- CD34-C-kit -/- 细胞（称为Kit ^-，参见图1的代表性图）（Pina等人，2012）。预计20-30％的在分化的第6天，培养物变成Kit ^-
  
  图1。 EML细胞的红细胞分化。流动的代表图显示了第4天的细胞计数分析; c-kit CD34 - 细胞是Sca1 -/- 。在在这种情况下，在第0天用一群细胞接种培养物具有培养 - 重建（或自我更新）潜力（Pina等人， 2012）。
7. 当接种红细胞分化培养物时与定向的红细胞（例如分选的Sca1 ^lo CD34 ^-细胞培养根据上述B1）（Pina等人，2012），60-80％的培养物是Kit ^- 第4天的分化，反映更快的分化动力学从定型细胞。
8. 不出意料，种子的文化红细胞定型的细胞较少增殖，具有10倍第4天预期的细胞数量的扩增，之后培养物高原并且变得不太可行。
嗜中性粒细胞分化条件
1. 使用来自维持培养的对数生长期的EML细胞，并以2×10 4个细胞/ml的接种浓度接种它们维持培养基+ 10ng/ml重组小鼠IL-3和10 μMATRA。
2. 生存力受细胞拥挤的影响小于红细胞分化，因此有可能种子培养物如果需要高细胞数，则密度更高（0.5-1×10 ⁵）
3. 2天后，用含5％HS + 2mM L-谷氨酰胺的IMDM洗涤细胞2-3次和1×P/S，并以2×10 4个细胞/ml重新接种在IMDM，5％HS，2mM L-谷氨酰胺和1×P/S，具有2.5％SCF-CM + 10ng/ml重组小鼠 GM-CSF和10μMATRA。
4. 保持文化增长总的7天（因此，另外5天），加入新鲜的GM-CSF（10ng/ml）第5天对现有文化
5. 它预计将观察到在培养期期间细胞数量的平均10倍扩增，在整个持续时间内具有接近80％或更高的存活率文化。
6. 可以确定细胞分化的程度通过用Gr-1和Mac-1抗体染色后的流式细胞术（Pina等 2012），其中粒细胞Gr1 + sup/+ Mac-1 + sup细胞的积累至预期比例为40-50％，培养4-5天（见图2 代表性图）。比例可以后来，虽然绝对分化细胞数持续增加。
  
  图2.EML细胞的嗜中性粒细胞分化。显示在第6天的流式细胞术分析的代表性图。

笔记

SCF条件培养基（SCF-CM）
1. 一种可能的来源是表达鼠试剂盒配体蛋白（MKL或SCF）的BHK细胞
2. 条件培养基可以在总产量为60ml /瓶的T175烧瓶中生产
3. 在含有10％FBS，2mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素的IMDM中培养细胞，直到它们达到80％汇合。
4. 在这一阶段，更换新鲜培养基和文化另外 48小时，此时收集上清液，漂浮细胞通过在400×g下沉淀5分钟除去，并将培养基过滤 0.2μm网。
5. 条件培养基可以等分并在-20℃下储存几个月而不丧失活性。

致谢

本文所述的方案最初在Pina等人（2012）中报道。其发展和实施得到英国医学研究委员会，白血病和淋巴瘤研究，EuroSyStem和STEMEXPAND的财政支持。

参考文献

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Pina，C.，Fugazza，C.，Tipping，A.J.，Brown，J.，Soneji，S.，Teles，J.，Peterson，C.and Enver，T。（2012）。推荐谱系承诺规则 haematopoiesis。 Nat Cell Biol 14（3）：287-294。
Tsai，S.，Bartelmez，S.，Sitnicka，E。和Collins，S。（1994）。通过含有显性负性视黄酸受体的逆转录病毒载体永生化的淋巴造血祖细胞可以重现淋巴样，骨髓样，和红细胞发育。 Dev 8（23）：2831-2841。
Ye，Z.J.，Kluger，Y.，Lian，Z.and Weissman，S.M。（2005）。多潜能造血细胞系中的两种类型的前体细胞 Proc Natl Acad Sci USA 102（51）：18461-18466。