图1.典型的鞭毛再生曲线显示在脱落前和再生期间拍摄的衣藻细胞的相衬图像。再生细胞群的平均鞭毛长度显示为红色和在非鞭毛细胞群上的平均鞭毛长度是蓝色的。

材料和试剂

单元格
衣藻细胞可以从多种来源获得，并且多种鞭毛突变体的纯株可以从衣藻资源中心获得（ http://chlamycollection.org/contact-us/）。

培养基和细胞培养（见注释）

0.5 N乙酸

0.5 M NaOH

2％戊二醛的M培养基或Lugols碘（见Recipes）
注意：对于电子显微镜，应该使用来自密封安瓿瓶的新鲜戊二醛。为了测量鞭毛长度，戊二醛的年龄不是关键的。

可选：

2.5％低EEO琼脂（Thermo Fisher Scientific，FisherBiotech< sup>，目录号：BP160-100）
注意：它用于观察鞭毛生长或维持个体活细胞。

5mM（终浓度）秋水仙碱（以抑制微管装配）
注意：这些实验在磷酸盐缓冲的最小培养基中进行。避免含有Tris的缓冲液，因为它们可能会抑制秋水仙碱的作用（Margulis et al。，1969）。

10μg/ml（终浓度）环己酰亚胺
注意：它用于抑制蛋白质合成。

VALAP（参见配方）
注意：它用于支持盖玻片以检查活细胞，而不会由于盖玻片压力而引起玷污。

设备

pH计，校准pH 4-7
注意：一些凝胶电极在这个pH范围内不准确。
离心机和试管
注意：对于小规模，临床离心机和锥形管。
相差显微镜或明场显微镜
注意：如果细胞用Lugol的碘固定，40x镜头是鞭毛长度测量的理想选择。
轨道振动器
磁力搅拌器
搅拌棒

软件

图片J（ http://imagej.nih.gov/ij/）

程序

检查单元格与一个40倍镜头和相位显微镜，以确定细胞是健康的，包含两个鞭毛，并动态（除非瘫痪突变体研究）。分裂细胞缺乏鞭毛并被包含4-8个细胞的折射性细胞壁包围。具有分裂细胞的培养物不是同步的，并且不用于再生实验
使用临床离心机，至多120ml培养物或低速制备型离心机（3分钟，1,500xg）灌注收获细胞（〜5×10 5个细胞/ml）离开上清液。
将细胞悬浮在烧杯中的20-100ml新鲜培养基中，通过轻柔旋转或通过大口径移液管轻轻地抽吸细胞（我断开塑料移液管的尖端）。
用相位显微镜检查细胞，以确保它们均匀鞭毛，并且在离心和重悬期间没有萎缩。
可选：琼脂糖在固定的活细胞上观察鞭毛。
1. 将2.5％低EEO琼脂溶解在培养基中并保持在45℃下使用。
2. 将细胞应用于干净的盖玻片，抽出大部分液体，并在40℃下应用〜20微升的琼脂糖。
3. 快速倒置在干净的显微镜载玻片上，并用VALAP（1：1：1凡士林，羊毛脂，石蜡）密封边缘。
4. 用温暖的抹刀将VALAP的边缘覆盖在盖玻片的边缘。
  注意：捕获再生鞭毛的延时图像使用a 显微镜，配备UV过滤器。保持照明低和确保非絮凝细胞在整个过程中保持全长观察期（见参考文献1）。
使用磁力搅拌器搅拌细胞，并滴加0.5N乙酸，直到pH达到4.5-4.0。尽可能快地加入乙酸，但要确保当加入到培养基中时它充分混合。保持在pH4不超过〜1分钟，然后通过滴加0.5N KOH将pH升高到6.8-7.2。对于在M培养基中的100ml细胞，使用约4.5ml的0.5N乙酸和5.2ml的0.5M KOH。对于大多数目的，最好监测pH变化，但是对于微量滴定板中的质量减少，添加规定量的乙酸和KOH是有用的。
用于再生
1. 使用临床离心机沉淀小细胞，并悬浮在新鲜的M培养基中至约10 5个细胞/ml。在新鲜培养基中悬浮并不重要，但我一般这样做。
2. 使用鼓泡器或通过在定轨振荡器上的锥形瓶中轻轻旋转在光照下孵育细胞。
3. 鞭毛一般将在10-15分钟内开始生长，并且将完全生长60-90分钟。
4. 为了测量再生细胞上的鞭毛，以5-10分钟间隔用戊二醛或Lugol碘固定样品。
  1. 固定：2％戊二醛在M培养基中。稀释100微升细胞+ 100微升的2％戊二醛并且在微量离心管中沉降。在1-2天内测量鞭毛。较长的固定会导致结块的细胞在管的底部，这使得测量个体鞭毛非常困难。
  2. 或者，修复稀释80微升细胞+ 20微升Lugol碘。在1-2天内测量鞭毛，以避免结块的斑点细胞
  3. 再生可以被可逆地抑制加入秋水仙碱，微管装配的抑制剂。如果环己酰亚胺在絮凝时加入，鞭毛再生将由于a的耗尽而限于半长对鞭毛集合至关重要的蛋白质库（Rosenbaum等人， 1969）。
测量鞭毛：有多种方法来测量鞭毛，一个必须平衡精度与容易测量大量鞭毛，以最大限度地减少错误。即使鞭毛在固定时是平面的，它们是弯曲的并且以各种角度观察，这取决于显微镜载玻片上的细胞的取向。如果细胞没有正确定向以显露鞭毛，则很短的鞭毛可能很难看到。还难以鉴定鞭毛基部，因为其被细胞壁包围，这可以遮蔽基部本体上方的鞭毛的第一微米。因此，观察者在测量鞭毛时必须使用他们的判断，并且与所有测量一致。可以使用涉及Z轴的复杂图像分析（参见参考文献9），但是也可以在不同时间点简单地使细胞瘪缩，将附着于盖玻片的分离的鞭毛照相，并且用各种图像程序测量它们的长度。 > 测量鞭毛最简单的方法是使用眼测微计，并用手记录固定细胞上鞭毛的测量值。我更喜欢使用与Image J（一个免费软件程序）互动的ccd或视频相机（ http：//imagej。 nih.gov/ij/）。使用鼠标跟踪鞭毛，保存测量，并使用Excel确定长度的平均长度和分布（使用直方图）或类似的电子表格
根据其他地方（这些方案）描述的方法，鞭毛容易从pH-震荡细胞中纯化。

笔记

关于媒体和细胞培养的注意事项
1. 您可以在 http://www.chlamy.org/media.html 上查看文化媒体食谱。 br />
2. 我更喜欢在Sager和Granick（1953）中在室温下培养细胞，最小（M）媒体（ http://www.chlamy.org/SG.html ; Harris ，1989）在12小时黑暗/光周期上同步细胞以确保所有细胞在细胞周期的同一点。这是很重要的，因为衣藻细胞在分裂前分解它们的鞭毛突变体pf18，后4-6 h逐渐解体其鞭毛光周期的开始（Tuxhorn等人，1998）。细胞密度不是但是细胞常常生长至静止期（> 10 6细胞/ml）不是100％鞭毛。
3. 高压灭菌器在锥形瓶中配有泡沫塞和棉塞玻璃巴斯德吸管室内空气或水族馆泵的曝气。为了deflagellation和再生，生长至〜5×10 5个细胞/ml的50-100ml细胞的培养物是足够的。
4. 为了分离鞭毛，在充气的4L瓶中培养8-16L细胞，并将细胞浓缩至100-200ml用于pH休克。

食谱

Lugol的碘
将6％碘化钾在蒸馏水中混合，加入4％碘晶体通过搅拌混合过夜并无限期储存

致谢

该方案改编自Lefebvre（1995），Margulis等人（1969）和Witman（1986）。

参考文献

Dentler，W.L.and Adams，C。（1992）。衣藻中的鞭毛微管动力学：细胞松弛素D诱导微管缩短和伸长的时期;并且秋水仙碱诱导鞭毛的远端但不是近端的一半的拆卸。 117（6）：1289-1298。

Gaertig，J.，Wloga，D.，Vasudevan，K.K.，Guha，M.and Dentler，W。（2013）。热敏四膜虫中睫状蛋白的发现和功能评价。 Methods Enzymol 525：265-284。
Harris，E.H。（1989）。生物学和实验室使用的综合指南。 The Chlamydomonas Sourcebook 。学术出版社
Lefebvre，P.A。（1995）。衣藻中的鞭毛截肢和再生。方法细胞生物学 47：3-7。
Margulis，L.，Banerjee，S。和White，T。（1969）。秋水仙素抑制性纤毛再生：对tris缓冲液介质中缺乏效应的解释。 164（3884）：1177-1178。
Quarmby，L.M。（2009）。泄漏。 In：Witman，G.B。（ed）。 The Chlamydomonas Sourcebook第二版。 Academic Press Vol 3：43-69。
Rosenbaum，J.L.，Moulder，J.E.and Ringo，D.L。（1969）。衣藻中的鞭毛伸长和缩短。使用放线菌酮和秋水仙碱来研究鞭毛蛋白的合成和装配。 J Cell Biol 41（2）：600-619。
Sager，R。和Granick，S。（1953）。使用衣藻属的营养研究。 Ann NY Acad Sci 56（5）：831-838。
Saggese，T.，Young，A.A.，Huang，C.，Braeckmans，K.and McGlashan，S.R。（2012）。开发测量3D原始纤毛长度的方法 Cilia 1（1）：11.
Tuxhorn，J.，Daise，T。和Dentler，W.L。（1998）。衣藻中鞭毛长度的调节。细胞毛细胞骨架 40（2）：133-146。
Witman，G.B。（1986）。隔离衣原体鞭毛和鞭毛轴突方法酶 134：280-290。