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...

Glycerol (Sigma-Aldrich, catalog number: G5516)

Albumin-dextrose-catalase (ADC) (BD, catalog number: 212352)

Oleic-albumin-dextrose-catalase (OADC) (BD, catalog number: 212351)

Potassium phosphate (monobasic) (KH₂PO₄) (Sigma-Aldrich, catalog number: P9791)

L-asparagine monohydrate (Sigma-Aldrich, catalog number: A8381)

Citric acid monohydrate (Sigma-Aldrich catalog number: C1909)

Ferric ammonium citrate (Sigma-Aldrich catalog number: F5879)

Zinc sulfate monohydrate (ZnSO₄^.H₂O) (Sigma-Aldrich, catalog number: 96495)

Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO₄^.7H₂O) (Sigma-Aldrich, catalog number: 230391)

Chelex 100 resin (Bio-Rad Laboratories, catalog number: 142-2822)

100x Halt Protease Inhibitor single use cocktail (Pierce, catalog number: 1860932)

100% trichloroacetic acid (TCA) (pre-chilled prior to use) (Sigma-Aldrich, catalog number: 49010)

Acetone (pre-chilled prior to use) (Sigma-Aldrich, catalog number: 32201)

Phosphate buffered saline (PBS) (Life Technologies, Gibco^®, catalog number: 10010-023)

Bromophenol Blue, sodium salt (US Biological, catalog number: 12370)

Tris (MP Biomedicals, catalog number: 02194855)

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) (US Biological, catalog number: 18220)

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Sigma-Aldrich, catalog number: E6758)

β-mercaptoethanol (2-ME) (Sigma-Aldrich, catalog number: M6250)

7H9完整媒体（见配方）

Sauton的媒体（见配方）

螯合的sauton的媒体（分枝杆菌生长的另一种基本培养基）（参见食谱）

蛋白质提取缓冲液（参见配方）

5x SDS-PAGE样品缓冲液（见配方）

设备

高压灭菌器
Steriflip-GV过滤单元（0.22μm孔径）（Millipore，目录号：SE1M179M6）
20ml注射器（BD，目录号：302830）
0.22μM注射器过滤单元（33mm）（Millipore，目录号：SLGV033RS）
一次性无菌过滤系统（1L，0.22μm孔径）（Corning，目录号：09761104）
0.1mm氧化锆/二氧化硅珠（Bio Spec Products，目录号：11079101z）
30ml方形培养基瓶（Nalgene ，目录号：NE/2019-0030）
125毫升方形媒体瓶（Nalgene ，目录号：NE/2019-0125）
50ml Falcon管（Corning，目录号430290）
15ml具有塞密封盖的falcon管（Corning，目录号：430052）注意：这些50ml管与有机溶剂和高速离心相容。具有这些功能的猎鹰管可以从不同的供应商使用。
微管（2ml带O形环的螺帽）（SARSTEDT AG，目录号：72.693）
分光光度计
带有用于旋转细菌培养物的摆动转子的离心机（例如，Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R;具有SX4750转子的台式离心机）
注意：
1. Msmeg和BCG应根据生物安全的实践标准进行处理。
2. 根据机构实践标准，Mtb文化应在生物安全3级设施中处理。
3. 离心BCG和Mtb需要适当的气溶胶控制。
在分枝杆菌培养物离心期间（例如Beckman Coulter，目录号：BK359232），贝克曼气溶胶罐包含气溶胶。
37℃振荡培养箱
用于在振荡培养箱中摇动BCG和Mtb液体培养基的气雾剂容纳单元注意：孵化器应放置在BSB3设施中用于Mtb培养。
用于CF的CFA沉淀的50ml聚丙烯镰刀的高速离心机（例如具有JLA16.2转子的Beckman Coulter离心机）
50 ml falcon适配器转子JLA16.2
Bead beater（Bio Spec Products，型号：Minibead beater 16; http://www.biospec.com/product/34/mini_beadbeater/）
带制冷的标准台式离心机
用于Eppendorf管的加热块（设置为95℃ ）
pH计

首字母缩略词

Mtb：结核分枝杆菌
BCG：牛分枝杆菌 Calmatte-Guérin
Msmeg： Mycobacterium smegmatis
WCE：全细胞提取物
CF：培养滤液
DlaT：分枝杆菌的Rv2215 /丙酮酸脱氢酶E2组分sucB蛋白
TCA：三氯乙酸
BSC：生物安全柜
OD <600>：波长为600nm的吸光度或光密度

程序

分枝杆菌培养物的接种和生长
1. 接种来自冷冻股票的分枝杆菌的液体培养物，制备从对数期中期分枝杆菌培养物（OD 600在0.5至1.0之间）其在-80℃下在18％甘油中冷冻。
  1. 对于接种，需要牢记分枝杆菌物种的倍增速率。 Msmeg大约每3小时翻倍，而BCG和Mtb翻倍大约在37℃下在7H9完全培养基中每20小时。
  2. 的将培养物接种在30ml正方形的10ml 7H9完全培养基中媒体瓶。如果需要，包括适当的抗生素。例如，抗生素可以适当的浓度包括在选择中质粒时，生长转化的分枝杆菌菌株。
  3. 的将分枝杆菌培养物在37℃下缓慢振荡在37℃下孵育速度为90rpm。 BCG和Mtb培养物置于气溶胶容纳中在摇动培养箱中
  4. 对于Msmeg，接种200微升从甘油储备液并生长过夜至饱和。稀释过夜培养1:40成新鲜7H9完全培养基，并生长至对数中期。对于BCG和Mtb，从冷冻储存物接种0.5ml。它会采取几天（〜4天）使培养物达到对数中期精确时间取决于初始接种物密度和生长条件。
2. 测量培养物的OD 600。确定需要达到至少0.25的最终起始OD 600的培养体积当重悬于25ml Sauton's培养基[培养体积（ml）= 25 ml×所需实验培养物的OD 600（例如0.25）/OD 600）。
3. 将这一体积的培养基转移到15毫升falcon管和通过在室温下以1500×g离心7分钟来沉淀细菌细胞温度。取出上清液，并在PBS中重悬沉淀。再次在1,500xg离心7分钟。这个洗涤步骤很重要去除从7H9完全培养基携带的白蛋白。
  注意：
  1. 根据我们对离心Mtb的实践的制度标准和BCG培养物，将falcon管置于离心适配器中放在Aerosolve 罐中（在Equipment，第14项中提到） II类生物安全柜（BSC II）。
  2. 这些从罩中移出并装载到转子中并离心。
  3. 旋转后，将具有猎鹰管的整个Aerosolve 罐带回BSC II罩并打开。
  4. 此程序包含离心过程中产生的气溶胶。 Mtb文化应在BSL3设施中处理。
4. 除去上清液，并重悬在1毫升的细菌沉淀 Sauton的媒体。转移到125毫升方瓶介质瓶 24ml Sauton's培养基（在Sauton's中包括合适的抗生素媒体）。在振荡培养箱中37℃孵育。
  注意：
  1. Sauton的培养基是其中分枝杆菌生长比它们在7H9完全培养基中更慢的最小培养基。
  2. 或者，如果金属离子对分泌的影响是有效的研究，可以使用螯合的Sauton's介质作为基本介质和添加定义的金属离子浓度。
5. 监视OD ₆₀₀ 文化。将培养物培养至0.5至0.8OD 600之间。大约需要6小时对于Msmeg和48小时的BCG和Mtb这个程序可以修改为以较低的密度接种细菌并允许它们生长更长的时间，这取决于实验的目的。
收获细菌培养物和WCE的制备
1. 如上所述在Sauton's培养基中孵育后，测定OD 600。
2. 计算对应于5OD 600单位的体积。例如，if 培养物的OD 600为0.5，则10 ml将对应于5 OD 单位（所需体积= 5/OD 600实验培养物）
3. 转移5 OD 600培养物到15ml falcon管（用于准备WCE）。将剩余的培养物转移到50ml的猎鹰管（用于从CF沉淀蛋白质）。离心两者管在2,000×g下在4℃下5分钟。
4. 合并上清液从15和50毫升猎鹰进入一个未使用的50毫升falcon管和存储在冰上，直到你准备好进一步处理它（见下文，在步骤C）中制备CF。
5. 通过在2,000×g，5分钟，4℃下重悬和离心，用5ml PBS洗涤沉淀在15ml Falcon中。
6. 弃去上清液，并再次悬浮在1ml PBS中的沉淀并将其转移到具有O形环的2ml Sarstedt管中（用于在珠粒搅拌期间容纳气溶胶）。
7. 旋转上台式离心机在3000×g下离心5分钟，弃去上清液。至沉淀加入300μl含蛋白酶的蛋白提取缓冲液抑制剂。通过pippettount重悬沉淀。
8. 分配100 μl的0.1mm氧化锆/二氧化硅珠倒入1.7ml eppendorf中并加入到含有颗粒的Sarstedt管
9. 使用珠搅拌器包含在II级生物安全柜内（请阅读珠子搅拌器手册的操作程序和也看到链接在设备中提供，项目19），珠粒在3.450下敲打样品1分钟振荡/min并将其置于冰上2分钟以冷却。重复此操作两次。这个样本是WCE。将裂解液全速离心2分钟 min在微量离心机中以在打开管之前沉淀泡沫。
  注意：
  1. 替代的珠子搅拌器可以具有不同的速度，因此用户应优化珠打（速度和时间）以最大程度裂解分枝杆菌颗粒。
  2. 可以通过在用于菌落形成单位的珠打之前和之后对细菌进行电镀来建立裂解的程度。
10. 对于SDS-PAGE，向Sarstedt添加60μl的5×SDS-PAGE样品缓冲液然后通过倒置轻轻混合。在95℃孵育5分钟。的加热步骤有助于样品变性和灭菌分枝杆菌裂解物。分枝杆菌WCE可以储存于-80℃。
  注意：Mtb的WCE通常可以传输出来的BSL3设施在这一步只要是一致的机构的实践标准。
11. 使用前，在室内解冻温度，然后在95℃加热5分钟。经常有20μl的WCE 足以进行SDS-PAGE和Western分析，尽管这个量会取决于目标蛋白水平和敏感性检测方法。
TCA沉淀的CF
1. 使用25ml注射器将来自步骤B9的培养上清通过0.22μM过滤器过滤到新鲜的50ml falcon管中。
  注意：
  1. 或者，可以使用50ml Steriflip-GV通过真空过滤过滤单位（0.22μM）以从上清液中除去任何细菌。
  2. 这可以根据上清液的浊度进行两次。
  3. 根据标准，也可能需要双重过滤操作程序从BSL3传送CF 设施。
2. 在冰上预冷三氯乙酸（TCA）。加 TCA至终浓度为12％至CF（3ml的100％TCA中 25ml样品）。倒置管几次混合和放猎鹰在4℃过夜。确保猎鹰管用于沉淀与有机溶剂和高速离心相容
3. 在4℃下将CF在15,000×g下旋转15分钟。
4. 小心弃去上清液，以免丢失沉淀。
5. 通过沿管的侧面缓慢加入5 ml丙酮（在4°C预冷），清洗剩余的TCA。
6. 在4℃下以15,000ing/g旋转15分钟。
7. 在这个阶段非常小心地弃去上清液，因为颗粒不紧密地粘附到管上。
8. 将管在II级BSC中打开10-20分钟以更快干燥的颗粒。不要过度干燥，以免溶解困难颗粒。
9. Resuspend the pellet in 150 µl 1x SDS-PAGE sample buffer. You may need to place tubes in a 65 °C water bath briefly to completely resuspend.
10. If samples turns yellow due to incomplete removal of TCA, add a few microliters of 1 M Tris-HCl (pH 8) until they turn blue again.
11. Store sample at -70 °C. Thaw before use. 10 µl of the sample may be enough for SDS-PAGE and western analysis, although the amount will depend upon the amount of the target protein and the sensitivity of the detection method.

笔记

对于与TCA沉淀不相容的应用，可以使用Centricon Plus-70离心过滤器单元按照制造商的说明书浓缩步骤B9的CF。这之后可以进行缓冲液交换至所需的缓冲液。必须小心使用具有小于在CF中待分析的目标蛋白质的分子量的截留分子量的膜的Centricons。

食谱

7H9完全培养基（1L）
7H9粉末4.7g
50％甘油4.0ml
20％Tween 80 2.5ml
水至900 ml
将7H9粉末溶解在水中，并加入甘油和吐温80 调整水量，使最终体积为900 ml
加入100ml OADC用于Mtb或100ml ADC用于Msmeg和BCG
通过0.22μM过滤器灭菌，并在4°C下储存（培养基可以保存长达6个月。如果补充了其他添加剂，如抗生素或盐，如果对光敏感，培养基应该适合于化合物储存或退化）
注意：或者，将7H9和甘油溶解在897.5ml水中，然后用无菌tween-80和100ml ADC/OADC补充，并如上所述在4℃下储存，高压灭菌。
Sauton的媒体（1升）
磷酸钾，一碱价0.5g
L-天冬酰胺一水合物4.0g
柠檬酸一水合物2.0g
柠檬酸铁铵0.05g 1％硫酸锌一水合物0.1ml
硫酸镁七水合物0.5g 100％甘油60ml
水至1 L
20％Tween 80 2.5ml
将上述组分（吐温80除外）溶于900ml水中
用5N NaOH将pH调节至7 用水将体积补至1升，
高压灭菌，冷却，并加入2.5 ml无菌20％吐温80.
如上所述在4℃下储存7H9完全培养基
Chelated Sauton的媒体（1升）
磷酸钾，一碱价0.5g
L-天冬酰胺一水合物4.0g
柠檬酸一水合物2.2g
甘油60 ml
20％Tween 80 2.5ml
水至1升
Chelex 100树脂10g 将组分溶解在水中
用5N NaOH调节pH至7.4，用水补足体积至1L 加入10g Chelex 100树脂，并在室温下搅拌培养基1-2天通过0.22μM过滤器单元灭菌
将1g MgSO 4·7H 2 O 7H 2 O溶解在5ml水中，通过过滤对其进行灭菌，并加入到灭菌培养基中。
将培养基保存在4℃下，如上所述用于7H9完全培养基
可以在螯合后加入限定浓度的金属，如铁，铜和锌
蛋白提取缓冲液（10ml）
1M Tris-Cl（pH7.5）0.5ml
0.5M EDTA 0.1ml
20％SDS 0.3ml
水9.1ml
这可以在4℃下制备和储存。
在使用前，立即加入Halt蛋白酶抑制剂混合物至最终浓度为1x，并保持冰上
5×SDS-PAGE样品缓冲液（50ml） 0.5M Tris（pH6.8）12.5ml
SDS 5 g
100％甘油25ml
溴酚蓝0.030g
β-巯基乙醇500μl
水至50ml
将SDS溶于Tris缓冲液和一些水中，然后加入甘油和溴酚蓝混合并用水补足体积至50ml 加入500μlβ-巯基乙醇以等分试样在-20°C下冻融

致谢

该协议最初用于公开的工作Mehra等人（2013）。这项出版的工作得到了NIH（R01 AI087682），Doris Duke慈善基金会，美国传染病学会，Michael Saperstein医学学者研究基金（纽约大学医学院），Potts纪念基金会和美国微生物学会。

参考文献

Mehra，A.，Zahra，A.，Thompson，V.，Sirisaengtaksin，N.，Wells，A.，Porto，M.，Koster，S.，Penberthy，K.，Kubota，Y.，Dricot， Rogan，D.，Vidal，M.，Hill，DE，Bean，AJ和Philips，JA（2013）。结核分枝杆菌型VII分泌的效应物EsxH靶向宿主ESCRT以损害运输。 a> PLoS Pathog 9（10）：e1003734。