材料和试剂

表达与感兴趣的启动子融合的荧光素酶（pIGWB435二元载体中的
PHT1; 1：Luc）的转基因拟南芥注意：可以在以下网址找到矢量信息： http：//shimane-u .org/nakagawa/pgwb-tables/2.htm 。
KH sub 2 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
砷酸氢钠七水合物（Sigma-Aldrich，目录号：A6756）
30 mM砷酸盐（参见配方）
0.36mM D-荧光素（Sigma-Aldrich，目录号：L9504）（参见Recipes）
约翰逊媒体（见配方）

设备

生长室[16小时光/8小时黑暗区（24℃/21℃）]
白色96孔板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655074）
MicroAmp光学粘合膜（Life Technologies，Applied Biosystem ，目录号：4311971）
发光计（centro LB 960）（Berthold Technologies）

软件

Mikro Win 2000软件

程序

在含有具有1mM磷酸盐的约翰逊培养基（0.6％琼脂）的培养皿中播种最小的转基因种子（每次处理24株植物），并在具有16小时光/8小时黑暗区域（24℃/21℃）7天
将幼苗转移到缺乏磷酸盐的约翰逊培养基（0.6％琼脂），并放置3天
向白色96孔板中加入200μl约翰逊液体培养基（无琼脂），然后通过倒置将单个幼苗转移到每个孔中。
注意：由于PHT1; 1在根中显着地表达，我们将幼苗颠倒。
向每个孔中加入D-荧光素底物（50μM终浓度），并孵育1小时
测量初始发光，即发光（0）。
向每个孔中加入砷酸盐（30μM终浓度），并用MicroAmp光学粘合剂膜覆盖板（参考参考文献1以了解PHT1的行为; 1响应于砷）。
使用Mikron Win 2000软件（每个孔的计数时间为2秒），使用光度计测量板每隔10分钟的发光。
计算荧光素酶活性百分比（％LUC活性）如下：
％LUC活性= [发光（n） - 发光（0）] /发光（0）* 100
发光（0）=在零时刻的发光率
发光（n）=在2个和连续读数下的发光
一旦我们计算每个时间点的％LUC活性，我们必须计算每个时间点的所有独立植物的平均发光。
也可以使用转移到微量培养板上的农杆渗入叶的1cm圆片在本氏烟草（<本生烟草）中测定萤光素酶活性，并如上所述进行。

食谱

30mM砷酸盐将468mg七水合砷酸氢钠溶于50ml水中
过滤灭菌
0.36mM D-荧光素将1mg D-荧光素与8ml dH 2 O混合在80-90℃温热30〜40秒使其溶解
将dH 2加到10ml ml/h 过滤灭菌（0.25μm）
储存于-20°C

约翰逊媒体

Macronutrientes	库存	ml stock/L
KNO <3>（4℃）	100 g/L	6.06 ml
（4℃）的水溶液中的溶解性。	100 g/L	9.446 ml
MgSO 4 .7H 2 O（4℃）。	100 g/L	2.46 ml

Micronutrientes	g for 100 ml stock 1,000x	ml stock/L
KCl（-20℃）	0.378克	1 ml
（-20℃）。	0.15457克
（20℃）。	0.0845克
（-20℃）。	0.0575克
CuSO 4 5H 2 O（-20℃）	0.01248克
MoO 4（-20℃）	0.00161克

	g for 200 ml stock 500x	ml stock/L
（4℃）的FeSO 4 （ajustar pH a 3.5 con H 2 SO 4>稀释剂） Proteger de la luz	0.1112克	2 ml

	库存	库存/L
肌醇（4℃）	50克/升	2 ml

MES	0.5 g/l
1％sacarosa	10 g/L
0.5％sacarosa	5 g/L

使用Milli Q水使体积达到1升
用KOH调节pH至5.7 0.6％琼脂
在高压灭菌后，加入磷酸盐KH 2 PO 4 4/
1M KH 2 PO 4：6.8g/50ml（过滤灭菌）
加入1ml/L，使终浓度为1mM

致谢

该方案由Castrillo等人于2013年的原始文章改编。这项工作得到了来自西班牙科学和创新部（GC）和La Caixa/CNB国际博士课程的研究金的支持到MTC）以及来自西班牙科学和创新部的研究授权（BIO2004-03759，BIO2007-66104，BIO2010-16687，AGL2007-61705，AGL2010-15151，CSD2007-00057，EUI2009-03993和BIO2011-29085）。

参考文献

Castrillo，G.，Sanchez-Bermejo，E.，de Lorenzo，L.，Crevillen，P.，Fraile-Escanciano，A.，Tc，M.，Mouriz，A.，Catarecha，P.，Sobrino-Plata，J 。，Olsson，S.，Leo Del Puerto，Y.，Mateos，I.，Rojo，E.，Hernandez，LE，Jarillo，JA，Pineiro，M.，Paz-Ares，J.and Leyva，）。 WRKY6转录因子限制拟南芥中的砷酸盐摄取和转座子活化。 a> Plant Cell 25（8）：2944-2957。