材料和试剂

小鼠
Histopaque 1083（Sigma-Aldrich，目录号：10831-100ml）
IMDM与Glutamax-1（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：31980-097）
胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11150）
青霉素/链霉素（Life Technologies，InvitrogenTM，目录号：15140-122）
干细胞因子（Pepro tech，目录号：250-03）
FLT-3配体（Pepro tech，目录号：250-31L）
重组小鼠IL-5（Pepro tech，目录号：215-15）
PBS（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：14200-166）
Diff-Quick染色试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23-122-929,23-122-952和23-122-937）
RBC裂解缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：R7757-100ml）
CCR3（R& D systems，目录号：FAB729F）
Siglec-F（BD，Pharmingen ^TM，目录号：552126）
IMDM细胞培养基（参见配方）

设备

6孔组织培养板
解剖工具：解剖刀，剪刀
1 ml注射器
15 ml无菌离心管
离心机
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
显微镜
血细胞计数器

程序

从6-8只小鼠收集股骨/胫骨。
注意：6-8周龄的小鼠将产生最低的低密度骨髓组分。
用PBS冲洗来自股骨/胫骨的骨髓，用移液管上下移动，将骨髓破碎成单细胞悬浮液。
在4℃下以300×g离心细胞8分钟。
重悬细胞在15毫升RBC裂解缓冲液，孵育2分钟，在37℃。
注意：如果使用少于6-8只小鼠，则不需要调整RBC裂解缓冲液的体积。如果使用超过6-8只小鼠，我们建议相应地按比例放大RBC裂解缓冲液，并在步骤5中放大用于中和RBC裂解缓冲液的PBS量。
加入30ml PBS以中和RBC裂解缓冲液。
在4℃下，在300×g下旋转细胞8分钟。
将细胞重悬在16ml PBS中
在15ml离心管中各加入4ml histopaque 1083
小心地将4ml来自步骤7的细胞层压至4ml在步骤8中制备的梯度1083。必须使用非常慢的速度以确保层不被扰乱。在该步骤结束时，应该有两个层：底部透明层包含页码1083和顶部混浊层接纳单元。
在室温下以400×g离心30分钟。离心机上的制动器需要处于关闭位置。
收集低密度部分与1毫升微量移液管。低密度部分在上层和下层之间的界面处。该级分的近似体积为0.5ml至1ml。
注意：低密度部分由于该部分的低密度骨髓细胞而混浊。其正上方的上层是透明的。与低密度部分相比，其正下方的下层应显着较少混浊。
用30ml PBS洗涤细胞并在300×g下旋转8分钟
将IMDM中的细胞用含有10％FBS，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Glutamax-1补充有100ng/ml干细胞因子和100ng/ml FLT-3配体，浓度为1x 10 ⁶/ml
板在6孔板（3ml）中每孔3×10 6个细胞/孔。
在第2天更换培养基，从每个孔吸取1.5毫升培养基，加入1.5毫升新培养基（见Recipes）。
注意：小心不要吸出细胞，因为细胞被固定在培养板的底部，但没有附着。
在第4天，收集所有细胞，在4℃下以300×g离心8分钟，用30ml PBS洗涤一次，然后以1×10 6个细胞/在含有Glutamax-1和10％FBS，100U/ml青霉素和100μg/ml补充有10ng/ml IL-5的链霉素的IMDM中培养6×10 6/ml。
每隔一天更换培养基。在每次培养基更换期间，应该计数细胞并将浓度调节至1×10 6/ml/ml。
在第14天，收集成熟嗜酸性粒细胞进行进一步研究。根据制造商的方案，可以通过CCR3和Siglec-F的FACS染色和/或细胞离心涂片制备物的Diff-Quik染色来评估嗜酸性粒细胞成熟度（图1）。

图1.成熟骨髓来源的嗜酸性粒细胞的形态学。根据制造商的方案通过Diff-Quik染色确定形态。

食谱

IMDM细胞培养基
与Glutamax-1的IMDM
10％FBS
100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素，补充有100ng/ml干细胞因子 100ng/ml FLT-3配体细胞浓度为1×10 6/ml/ml

致谢

该协议已经从Lu等人修改（2013）。

参考文献

Lu，T.X.，Lim，E.J.，Besse，J.A.，Itskovich，S.，Plassard，A.J.，Fulkerson，P.C.，Aronow，B.J.and Rothenberg，M.E。 MiR-223缺陷增加嗜酸性粒细胞祖细胞增殖。 J Immunol 190（4）：1576-1582。