图2.快照在记录过程的不同步骤（Petersen ，2010）下可视化U2OS细胞

材料和试剂

细胞（例如U-2OS，ATCC，目录号：HTB-96）
生长培养基（例如具有6％血清的RPMI 1640，Life Technologies，Gibco ）
吖啶橙（Sigma-Aldrich，目录号：235474）
含3％血清的PBS

设备

Zeiss Live DUO 5共聚焦显微镜或任何能够以高速（500ms /曝光），100mW二极管激光器，40x c-消色差物镜物镜记录共焦图像的新型显微镜型号
Lab-Tek 4孔（目录号：155383）或8孔（目录号：155411）的硼硅酸盐电池室

程序

协议版本的注意事项：此协议存在两个版本，一个用于常见的癌细胞系（如U2OS或Mcf7）和一个用于转导SrcY527F癌基因或空载体的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）（或实际上任何其他感兴趣的转导的基因）。两种方案之间的主要区别是在共焦显微镜上记录图像。当需要时，将在每个步骤和两个版本进行描述指定为COMMON或MEF。

在硼硅酸盐实验室孔中生长细胞过夜或根据必要的治疗所需时间。生长培养基的确切性质并不重要。在分析当天，每个孔中的细胞量对于该方案的成功使用是关键的。为了保持变化低，细胞应该是50-75％汇合，并且不应该达到100％汇合。
将吖啶橙直接加入到生长培养基中至终浓度为2μg/ml。在37℃孵育细胞20分钟。
在含有3％血清的PBS中洗涤细胞两次
加入含3％血清的PBS以覆盖细胞（分别为8孔或4孔的100或200μl）。
立即进行在显微镜下的分析。细胞仅适用于洗涤后第一个60分钟的分析。此后，不同观察视野之间的变化将增加。
识别明亮的领域中的一组细胞，并确保溶酶体（可视为黑点）在焦点。在这一点很快，因为brightfield也包含蓝光。

显微镜设置：
该方案开发并用于Zeiss LSM 5LIVE DUO显微镜。重要的是要注意，对于所有的显微镜协议，确切的设置应该根据经验确定每个仪器和实验设置。如上所述，用于"正常"癌细胞系（即U2OS和Mcf7）的方案不同于用于MEF的方案。由于溶酶体在这些细胞中快速失去它们的完整性，使得定量在高速记录时具有挑战性，因此开发了用于MEF的较少帧（和较少暴露于蓝光）的较慢方案。

加热室	37ºC
眼睛	40x c-apochromat
激光强度	2.6（大多数癌细胞系）/0.9（MEF）（仪器之间差异很大）
图像质量	8位（16位使文件不必要大）
录制速度	1帧每0.5（大多数癌细胞系）/12秒（MEF）
图片已记录	200（大多数癌细胞系）/120（MEF）
激光波长	489 nm
录制过滤器	495-555nm带通（绿色），650nm长通（红色）

录制电影。任何焦点校正应在记录的前10秒内进行。确保不要记录相同的地方两次（容易看到，由于没有红点）。允许在一小时内分析所有孔的时间。请注意记录的顺序，以便稍后进行故障排除。

数据分析

使用LSM5 DUO软件分析数据。这个软件已经被蔡司升级到各种版本的ZEN。不幸的是，此更新中省略了此分析的关键功能，因此在旧版软件中执行数据分析。希望这将由Zeiss纠正，也许其他显微镜和软件供应商没有这些问题。

在Zeiss软件中打开电影。
选择ROI（感兴趣区域）分析。
确定每个通道（或颜色）要分析的最小像素强度。这是使用"level"函数完成的。在写作时，ZEN软件只能在单个图像上执行此操作，而不是构成此协议中记录的电影的多个图像帧。较早的Zeiss软件可以做到这一点。
1. 10秒后将电影转发到第一帧。
2. 标记整个框架与ROI工具。在此协议的以前版本单个细胞被手动标记，然而这是非常劳动密集，不会产生更好的效果。
3. 为绿色通道，改变要分析的像素强度的最小水平，所以所有背景都省略（单元格的整个区域应该是用弱绿色染色可见）。
4. 对于红色通道，更改水平，以便只分析亮红色的溶酶体
5. 所有电影都应使用相同的数字设置。
6. 由于每个帧包含多个单元格，由软件现在应该反映平均绿色和红色强度细胞。观察到绿色值增加而红色值随溶酶体爆发而减少
7. 将值从显微镜软件直接复制到Excel或类似的程序。
在excel中，排列来自相同实验设置的数据集。应分析至少三个独立实验，每个实验有3-4部电影
将每部电影标准化为其值为10秒。
在x/y散点图中可视化绿色的增加。红色的减少远不如绿色的增加可靠。警告，这会产生大而复杂的电子表格（图3）。
对于统计评估，可以对各个时间点（例如，20秒时的对照值与20秒时的治疗值）进行简单的学生t检验。

图3. Excel中的数据集示例

笔记

重要的是要强调，应该非常小心地标准化细胞生长条件，因为该测定的结果受到融合和细胞的一般健康状态的极大影响。此外，脂质介导的转染方案可以负面影响溶酶体的完整性，使它们更不稳定。最后，预计在每部电影结束时，绿色染色的强度将朝向每个电影的结束开始减小，因此当显示图形时，为了清楚起见通常需要省略晚期值。

致谢

该方案是针对解决溶酶体稳定性的两篇论文开发的（Petersen等人，2013和Kirkegaard等人，2010）。这项工作得到了丹麦癌症协会（NHTP和MJ），丹麦国家研究基金会，丹麦独立研究委员会，欧洲委员会FP7和Novo Nordisk基金会（MJ）的资助。

参考文献

Brunk，U.T.，Dalen，H.，Roberg，K。和Hellquist，H.B。（1997）。溶酶体膜的光氧化破坏导致培养的人成纤维细胞凋亡。 Free Radic Biol Med 23（4）：616-626。
Kirkengaard，T.，Roth，AG，Petersen，NH，Mahalka，AK，Olsen，OD，Moilanen，I.，Zylicz，A.，Knudsen，J.，Sandhoff，K.，Arenz，C.，Kinnunen， Nylandsted，J。和Jäättelä，M。（2010）。 Hsp70可稳定溶酶体并恢复尼曼 - 皮克病相关溶酶体病理。自然 463（7280）：549-553。
Petersen，N.H.，Kirkegaard，T.，Olsen，O.D.andJäättelä，M。（2010）。连接Hsp70，鞘脂代谢和溶酶体稳定性细胞周期 9（12）：2305-2309。
Petersen，NH，Olsen，OD，Groth-Pedersen，L.，Ellegaard，AM，Bilgin，M.，Redmer，S.，Ostenfeld，MS，Ulanet，D.，Dovmark，TH，Lonborg，A.，Vindelov，SD ，Hanahan，D.，Arenz，C.，Ejsing，CS，Kirkegaard，T.，Rohde，M.，Nylandsted，J.andJäättelä，M.（2013）。神经鞘脂代谢的转化相关变化使细胞对由酸性鞘磷脂酶抑制剂诱导的溶酶体细胞死亡敏感。/a> Cancer Cell 24（3）：379-393。