材料和试剂

NIH3T3细胞或HEK293细胞
纯化的活性Wnt3a蛋白（ATCC，目录号：CRL2647TM）
胎牛血清（FBS）
DMEM（高葡萄糖）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11965）
TransIT-2020（Mirus Bio LLC，目录号：MIR5404）
TCL/LEF-萤火虫荧光素酶表达构建体（Addgene，目录号：12456）
pRL-SV40-海肾萤光素酶表达构建体
注意：pRL-SV40-Renilla荧光素酶表达构建体是在Beachy's博士实验室。
Dual-Luciferase @ Reporter Assay System（Promega Corporation，目录号：E1960）
生长培养基（参见食谱）
Wnt3a条件培养基（参见配方）
血清剥夺的媒体（见配方）

设备

T75培养瓶（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353135）
24孔组织培养板（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353047）
96孔平底板（Corning，Costar ，目录号：3915）
离心机（Eppendorf，型号：8810R）
水浴
CO <2>孵化器
Berthold照度计（Berthold Tecnologies，型号：Centro XS LB960）

程序

从液氮库生长低通量NIH3T3或HEK293细胞
1. 在37℃水浴中简单解冻细胞
2. 吸管细胞成15 ml热科学Nunc锥形管中，并在1,500x下旋转5分钟 g 。吸出培养基，将细胞重悬在15ml生长培养基中并平板 T75培养瓶（细胞以1×10 6个细胞/孔的密度铺板）在37℃，5％CO 2下培养）
3. 当细胞生长到60％亚汇合时分裂细胞。
4. 细胞系应进行传代培养一或两次进行实际测定，然后将细胞平板到24孔平板，根据实验条件（5×10 4个细胞/孔）一式三份。
转染
1. 第0天：在总体积为500μl完全生长培养基（DMEM/10％FBS）中的种子细胞（如上所述的密度）。
2. 第1天：转染（使用比例为7XTCL/LEF-萤火虫荧光素酶： pRL-SV40-海肾荧光素酶为10：1; 使用1.5μlTransIT-2020/300 ng DNA/well）
3. 第2天：转染后24小时更换培养基（最佳）
4. 第3天：更换为血清贫乏的培养基。
5. 第5天：裂解细胞（1×全细胞裂解缓冲液，双荧光素酶@报道测定系统）并收集等分试样来自细胞裂解的上清液（20μl），将它们平板接种到96孔板中。
读取发光信号
1. 解冻双荧光素酶报道试剂。
2. 闪光和素数 Berthold发光计与萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶底物试剂。萤火虫荧光素酶底物是的衍生物 D-荧光素。响应D-荧光素酶活性（萤火虫荧光素酶），将产生萤火虫荧光素酶化学反应氧化荧光素和可以检测的560nm处的特定光信号通过发光计。海肾荧光素酶底物是的衍生物腔肠素。响应海肾酶活性（海肾荧光素酶），会产生海肾荧光素酶化学反应腔肠酰胺和可以检测的480nm的特定光信号通过发光计。向每个底物中顺序加入20μl 所产生的光度计和光信号被立即测量发光计（在封闭室中检测光信号照度计在环境温度下）
3. 阅读萤火虫和海肾萤光素酶信号（萤火虫荧光素酶信号在在480nm检测海肾荧光素酶信号）。

代表数据

图1.在未处理和Wnt3a处理的条件下测量萤火虫和海肾萤光素酶信号。相对萤火虫/海肾信号被归一化为未处理条件的诱导倍数。相对萤火虫荧光素酶（FL）/Renilla荧光素酶（RL）=原始FL/Raw RL
注意：在Wnt3a刺激条件下FL/RL的倍数变化在未刺激条件下归一化为FL/RL。

食谱

生长介质
对于NIH3T3和HEK细胞：DMEM + 10％FBS + 1％PS
Wnt3a条件培养基
通过收集稳定表达L-Wnt3a蛋白的小鼠成纤维细胞的上清液，然后以1:10的比例在DMEM + 2％FBS + 1％PS中稀释来制备Wnt3a条件培养基。
血清剥夺的媒体
DMEM
2％FBS，含有各种浓度的Wnt3a条件培养基

致谢

该协议改编自Kim等人（2010）。我感谢当前和过去的沙滩实验室，斯坦福大学的成员，他们为这个协议的发展做出了贡献。我承认苏珊G. Komen治愈博士后研究金：KG111253。

参考文献

Kim，J.，Lee，J.J.，Kim，J.，Gardner，D.and Beachy，P.A。（2010）。砷通过阻止睫状体积聚和降低Gli2转录效应物的稳定性来拮抗Hedgehog通路。 Proc Natl Acad Sci USA 107（30）：13432-13437。