材料和试剂

HEV Kernow-C1 p6/luc质粒（表达Gaussia荧光素酶的基因型3亚基因组复制子;来自Suzanne Emerson，NIH的赠品）（Shukla等人，2012）
MluI限制性内切酶与伴随的10x缓冲液D（Promega Corporation，目录号：R6381）
pT7-IRES-FFLuc-YFsfRNA质粒（内部构建; IRES，内部核糖体进入位点; FFLuc，萤火虫荧光素酶; YFsfRNA，黄热病毒小黄病毒RNA）（Debing等人，
引物＃1（5'-CATATGTCGACTAATACGACTCACTATAGGGATCCGCCCCTCTCCC-3'）和＃2（5'-AGTGGTTTTGTGTTTGTATG-3'）（定制序列）（Integrated DNA Technologies）（在缓冲液TE中溶解至终浓度为10μM）
Kapa HiFi HotStart ReadyMix主混合物（Kapa Biosystems，目录号：KK2601）
用于凝胶电泳的SeaKem LE琼脂糖（Lonza，目录号：50001）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
T7 RiboMAX大规模RNA生产系统（Promega Corporation，目录号：P1300）
RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN，目录号：74104）
ScriptCap m7G加盖系统（CELLSCRIPT ^TM，目录号：C-SCCE0610）
Huh7人肝癌细胞系（Japanese Collection of Research Bioresources，目录号：JCRB0403）
具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，目录号：41965-039）
胎牛血清（FBS）（非热灭活）（Life Technologies，目录号：10270-106）
Opti-MEM I还原血清培养基（Life Technologies，目录号：31985-062）
Lipofectin转染试剂（Life Technologies，目录号：18292-011）
不含Ca 2+和Mg 2+的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，目录号：14190-094）
萤光素酶测定系统（Promega公司，目录号：E2810）
5x被动裂解缓冲液（Promega Corporation，目录号：E1941）和用于稀释的去矿质H 2 O 2。
荧光素酶测定系统（Promega Corporation，目录号：E1501）
CellTiter 96 AQueous MTS试剂粉末[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑]（Promega Corporation，目录号：G1111）
吩嗪硫酸甲酯（PMS）（Sigma-Aldrich，目录号：P9625）
最低必需培养基（MEM）（无谷氨酰胺，无酚红）（Life Technologies，目录号：51200-046）
三（羟甲基）氨基甲烷粉末（Trizma碱）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）（溶解至1M，pH8.0，在H 2 O中）
乙二胺四乙酸二钠盐溶液（EDTA，0.5M）（Sigma-Aldrich，目录号：E7889）
MTS/PMS解决方案（参见配方）
缓冲TE（参见配方）

设备

用于确定RNA浓度的分光光度计（例如 Thermo Fischer Scientific，NanoDrop，型号：ND-1000）
Falcon透明96孔板（Corning Incorporated，目录号：353072）
培养平板白色96孔板（PerkinElmer，目录号：6005680）
37℃和35℃5％CO 2细胞培养孵化器
板振动器
用于发光和吸光度的Saphire²酶标仪（Tecan Trading AG）

程序

在含有10μl10×缓冲液D和2.5μlMluI（10单位/μl）的100μl反应物中将5μgKernow-C1 p6/luc质粒线性化，其在37℃温育2小时。 >
使用Qiaquick凝胶提取试剂盒根据制造商的说明纯化消化的DNA，在30μl缓冲液EB中最终洗脱。
注意：为了提高产量，向反应和缓冲液QG的混合物中加入推荐量的异丙醇。其他DNA纯化方法也应该适用。
使用引物＃1和＃2从pT7-IRES-FFLuc-YFsfRNA质粒扩增T7-IRES-FFLuc-YFsfRNA片段（2.6kb）：
- 12.5μl2x Kapa HiFi HotStart Readymix
- 0.75μl两种引物（溶解于10μM）
- - 0.5μl质粒（1-10ng DNA）
- 加入25μl不含核酸酶的H 2 O 2/b 使用以下温度方案：
- 5分钟95℃
- 20"98°C |
- 15"65°C | x25
- 3分钟72°C |
- 5分钟72℃
- 4°C
所得DNA片段在1％琼脂糖凝胶上纯化，并根据制造商的说明书用Qiaquick凝胶提取试剂盒提取，最后在30μl缓冲液EB中洗脱。
使用T7 RiboMAX大规模RNA生产系统为两个DNA片段制备体外转录反应：
- 10μl5x T7转录缓冲液
- 15μlNTP（ATP，GTP，CTP，UTP;全部为25mM） - 20μlDNA模板
- 5μl酶混合物
将反应在37℃孵育5小时。之后，加入5μl提供的RQ1 RNase-free DNase溶液，并在37℃下孵育15分钟。
根据制造商的说明书，使用RNeasy微型试剂盒纯化所产生的RNA，在60μl无RNase的H 2 O（在2次洗脱中各30μl）中洗脱。通过光谱法（260nm处的吸光度）测定RNA浓度
根据制造商的说明书，用ScriptCap m7G帽系统覆盖60μgHEV Kernow-C1 p6/luc RNA。
根据制造商的说明书，使用RNeasy微型试剂盒纯化所产生的RNA，在60μl无RNase的H 2 O（在2次洗脱中各30μl）中洗脱。通过光谱法（260nm处的吸光度）测定RNA浓度
将Huh7细胞以每孔10 10个细胞接种在100μl补充有10％FBS的DMEM中的透明96孔板中。
将板在5％CO 2培养箱中在37℃孵育24小时
为了转染一个孔，将36.5ng加帽的病毒RNA和36.5ng的FFLuc转染对照RNA加入3.65μlOpti-MEM中。在另一个管中，将0.365μl的Lipofectin转染试剂加入到3.65μlOpti-MEM中。将两管在室温下温育30分钟。然后，将两个管的内容物合并，并在室温下再温育10分钟。再加入29.2μlOpti-MEM，将所得溶液充分混合注意：将指示的量和体积乘以孔的数量，以转染并额外补充10％。对于没有复制子的细胞对照（CC）孔，省略病毒RNA。
从早期接种的细胞中除去培养基，每孔用100μlDMEM洗涤注意：Huh7细胞可能容易从培养板上脱落，因此使用移液管而不是真空系统小心地除去培养基。
向每个孔中加入36.5μl转染混合物
将板在5％CO 2培养箱中在37℃下孵育5小时
从每个孔中除去转染培养基，并用100μlPBS洗涤细胞层一次
向每个孔中加入100微升补充有10％FBS的DMEM。在该步骤中，加入待测试的化合物，并进行适当的稀释系列注意：没有化合物添加到病毒控制（VC）和CC井。
将板在5％CO 2培养箱中在35℃温育72小时注意：如果在35°C没有孵化器，也可以在37°C孵育。
从每个孔中，将20μl转移至白色培养板
将海肾荧光素酶底物在测定缓冲液中以1:100稀释，并将50μl加入含有转移的培养基的CulturPlate的每个孔中。
将板在板振荡器上剧烈摇动几秒钟并进行发光读出（积分时间：100ms）。
注意：基底添加和读出之间的时间必须保持最小，因为背景信号将在最初几分钟内随时间增加。后来，整体信号会下降。
从转染的96孔板的每个孔中除去剩余的培养基
将被动裂解缓冲液在去离子H 2 O中以1:5稀释，并向每个孔中加入20μl。
将板在室温下在500rpm下摇动10分钟以进行适当的细胞裂解
将100微升重组的萤火虫荧光素酶底物溶液加入新的白色CulturPlate的孔中。
将所有细胞裂解物溶液转移到CulturPlate中的荧光素酶底物溶液中
将板在板振荡器上剧烈摇动几秒钟，并如上所述进行发光读出。
为了评估化合物毒性，可以进行以下测定：
1. 如所述接种Huh7细胞，并在5％CO 2培养箱中在37℃温育24小时。
2. 培养基用补充有10％FBS（每孔100μl）的新鲜DMEM中的化合物稀释系列代替。将板在5％CO 2培养箱中在35℃温育72小时
3. 除去培养基并用100μl1:20稀释的MTS/PMS溶液（无色MEM /孔）代替。将板在5％CO 2培养箱中在37℃温育，直到出现褐色（通常这需要孵育1-2小时）。
4. 通过确定498nm处的光密度（OD）进行吸光度读数（CC的OD应该高于0.6但低于1以保持在线性范围内）。

代表数据

96孔板的可能轮廓可能如下：
基于发光的测定的典型读数如下：

p6/luc转染孔
CC井

相对发光单位（RLU）
85264
759

在相同实验的不同重复之间的Gaussia 发光读数的变异性可能相当大。这可以通过将数据归一化为未处理的VC井获得的数据来解决

笔记

T7-IRES-FFLuc-YFsfRNA用作转染对照以使转染效率正常化（参见下面的计算）。也可以使用其它表达FFluc的RNA片段。可以省略转染控制，尽管这可能影响测定的稳健性
以下公式用于计算抗病毒活性（％）。首先，将 Gaussia 荧光素酶信号标准化：
LucNorm 化合物 =（GLuc复制子+化合物-Gluc CC）/FFLuc复制子+化合物
LucNorm _VC =（Gluc VC - Gluc CC ）/FFLuc 接下来，计算抗病毒活性：
％抗病毒活性= 100-（LucNorm化合物/LucNorm VC×100）
例如，如果将获得以下发光数据：

化合物
VC
CC

Gluc
18524
85264
759

FFLuc
10362
9254
8906，

抗病毒活性计算如下：
LucNorm _compound =（18524 - 759）/10362 = 1.71
LucNorm _VC =（85264 - 759）/9254 = 9.13
％抗病毒活性= 100 - （1.71/9.13×100）= 81.3％
为了计算细胞存活率，可以采用以下公式：
％活力= OD化合物/OD CC×100
相同的方案可以用于Sar55/S17/luc构建体，基因型1亚基因组HEV复制子（Nguyen等人，2014）。

食谱

MTS/PMS溶液
1. 将2克MTS粉末溶解在1升PBS中并搅拌15分钟
2. 接下来，加入46mg PMS粉末（pH应在6-6.5之间）
3. 将溶液过滤，分装并储存在-20℃
注意：由于MTS是光敏的，所以粉末和溶液应该避光。
缓冲区TE
向25ml无核酸酶的H 2 O 2中加入
250μl1M Tris溶液（pH8.0）（终浓度：10mM） 50μl0.5M EDTA溶液（终浓度：1mM）

致谢

该协议改编自Debing等人（2014），并且部分基于Shukla等人早期的工作（2012）。 Yannick Debing是研究基金会佛兰德斯（FWO）的研究员。这项工作由KU Leuven Geconcerteerde Onderzoeksacties（GOA/10/014）和欧盟FP7项目SILVER（260644）支持。

参考文献

Debing，Y.，Emerson，S.U.，Wang，Y.，Pan，Q.，Balzarini，J.，Dallmeier，K.，Neyts，J。（2014）。利巴韦林通过消耗细胞GTP库来抑制体外的艾滋病病毒复制[/em]并且与α干扰素具有中等协同作用。 Antimicrob Agents Chemother 58（1）：267-273。
Nguyen，H.T.，Shukla，P.，Torian，U.，Faulk，K.，Emerson，S.U。（2014）体外对猪肾细胞的E型肝炎病毒基因型1感染在多个水平受到抑制。 J Virol 88（2）：868-877。
Shukla，P.，Nguyen，H.T.，Faulk，K.，Mather，K.，Torian，U.，Engle，R.E.，Emerson，（2012）基因型3戊型肝炎病毒适应细胞培养物中的有效生长取决于通过重组获得的插入的人基因区段。 J Virol 86（10）：5697-5707。