材料和试剂

（ 1021，Galibert ，2001）
注意：该协议也可应用于其他细菌。
Bio-Rad蛋白测定试剂盒I（Sigma-Aldrich，目录号：500-0001）
黄酮标准：
1. 核黄素（Sigma-Aldrich，目录号：95170）
2. FMN（Sigma-Aldrich，目录号：F2253）
3. FAD（Sigma-Aldrich，目录号：F6625）
4. Lumichrome（Acros，目录号：146930010）
注意：如前所述进一步纯化FMN和FAD（Sandov等人，2008）。
甲酸铵
甲酸
甲醇
YMB培养基（Somerville和Kahn，1983）（参见Recipes）（每个样品1个平板）
MMNH 4介质（Somerville和Kahn，1983）（参见Recipes）（每个样品6ml）
提取缓冲液（参见配方）
HPLC流动相（参见配方）
注意：除非另有说明，所有其他化学品均获自Sigma-Aldrich。

设备

铝箔
Eppendorf 1.7ml管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-222-168）
14ml Falcon管（BD Biosciences，目录号：352059）
0.22μm用于HPLC样品制备的注射器过滤器（Microsolv Technology，目录号：58022-N04-C）
Scale（Ohaus Corporation，型号：E10640）
微型离心机
振动器
HPLC：Waters Alliance 2695 HPLC系统连接到2475荧光检测器
SunFire C18反相柱（4.6×150mm，3.5μm）

程序

细胞生长
1. 成长。 meliloti在YMB板上在30℃下培养48小时。 S的最佳温度。 meliloti生长在28℃和30℃之间。
2. 接受。在3ml MMNH 4培养基中从原液YMB平板将细胞密度调整至〜600的OD 600。
3. 生长细胞在30°C下48小时，250 rpm在14毫升Falcon或玻璃管完全包装箔，以防止光诱导黄素降解。在测试光生长培养物中的黄素水平或通过光的黄素降解的情况下，可以省略箔。
4. 将细胞稀释20倍至3ml新鲜MMNH 4培养基中，并在30℃，250rpm下在覆盖有铝箔的14ml Falcon或玻璃管中生长1或3天。细胞生长的长度可以从几小时到10+天，这取决于研究的具体问题。
5. 取出1毫升的生长培养物进行蛋白质定量。这些1ml样品可以在-20℃冷冻用于后期蛋白质定量。（其余2ml细胞培养物将用于黄素检测，步骤B，C和D.）
6. 对于蛋白质测定，通过超声（Fisher Sonic Dismembrator 300，中间尺寸附件和功率设置为60％，每次3分钟，在4℃下）破碎细胞。
7. 通过离心（≥3,000 x g ;室温; 20分钟）除去细胞碎片。
8. 通过使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒测量培养物中的蛋白质浓度。
  ote：执行黄色素提取和分析程序的其余部分，因为黄素是非常光敏的。通过存储在不透光的容器中保护提取和过滤的黄素从光。对于长期储存，样品可以在0℃以下储存在不透光的容器中。
从条件培养基中分离细胞
1. 通过在预称重的Eppendorf管中离心（≥10,000×g;室温; 20分钟）从1ml培养物收获细胞。
2. 转移上清液清洁Eppendorf管。它将用于步骤C中，并且可以在-20℃下储存在箔包裹的Eppendorf管中，用于以后分析。
3. 用1ml MMNH4缓冲液洗涤沉淀，离心（≥10,000×g;室温; 20分钟）。
4. 移出所有液体，重新称量管以测量团块质量。根据生长时间的不同，预期团块质量在5mg和10mg之间的范围内
5. 颗粒将在步骤D中使用，可以在-20℃下储存在箔包裹的Eppendorf管中用于以后分析。
测量分泌黄素
1. 使用Microsolv 0.22μm注射器过滤器过滤收获细菌后留下的上清液（步骤B）
2. 对于核黄素，FMN和FAD检测，通过反相色谱法使用具有Waters SunFire C18柱（4.6×150mm，3.5μm）的Waters Alliance 2695 HPLC系统分离样品， 35℃连接到Waters 2475荧光检测器。通过使用470nm的激发波长和530nm的发射波长来检测核黄素，FMN和FAD。以1ml/min的流速运行流动相，每个样品12分钟。将样品保持在10°C。
3. 对于荧光检测，分别使用260nm和470nm的激发和发射波长。使用表1所示的流动相梯度程序。柱和流速与上述相同。运行流动相15分钟。柱温35℃
4. 通过与标准品（0.05,0.1,0.5,1.0和5.0μMFAD，FMN和核黄素）比较来确定黄素浓度。
5. 根据蛋白质浓度标准化黄素浓度（如上步骤A8中计算的）
  表1. lumichrome检测的溶剂梯度程序参数
  
  时间（分）
  水（％）
  甲醇（％）
  
  0
  77
  23
  
  8
  40
  60
  
  11
  40
  60
  
  12
  0
  100
  
  13
  0
  100
  
  14
  77
  23
  
  15
  77
  23
  
  *流速1ml/min
测量细胞内黄素浓度
1. 将来自步骤B的细胞沉淀物在提取缓冲液（1:10w/v）中重悬，在80℃加热10分钟，然后在4℃下以20,000×g离心20分钟。
2. 使用0.22μm注射器过滤器过滤上清液。
3. 测量核黄素，FMN，FAD和lumichrome，如分泌黄素所述。

代表数据

Fi gure 1。黄病毒分泌和由 e meliloti meliloti 株生长在MMNH 4介质中。生长3天后取1ml细胞培养物。将细胞离心并测量粒料的质量。使用HPLC测量上清液和沉淀中的Lumichrome（LMC），FMN，FAD和核黄素（RF）浓度。相对于蛋白质浓度标准化黄素浓度。 Rm1021 - 野生型菌株; Rm1021Δ ribA a ndRm1021Δ ribBA -Rm1021突变体具有降低的黄素调节能力; Rm1021ΔribBAxpCPP30 ribBA -Rm1021突变体，具有恢复的黄素的保藏能力。从至少三次独立实验中平均数据。

食谱

用于根瘤菌的YMB培养基

1 L
集中

酵母提取物
1克

甘露醇
10克
54.9 mM

Agar
15克

高压灭菌，冷却至55°C，然后加入

YMB盐I
10 ml

YMB盐II
10 ml

YMB盐I
1 L
集中

K _{2 HPO ₄} 50克
287.06 mM

NaCl
10克
171.15 mM

d H 2 O 2 960 ml

YMB盐II
1 L
集中

MgSO 4。。 O
20克
81.11 mM

d H 2 O 2 1 L

MMNH4（用于Rhizo 的最小甘露醇氨培养基）

每1 L
集中

甘露醇
10.0克
54.9 mM

NH 4 Cl
0.5克
9.34 mM

琼脂（用于平板制备）
15.0克

d H 2 O 2 970 ml

高压灭菌，冷却至55°C，然后添加：

生物素（0.2mg/ml，在50％EtOH中） 1.0 ml

硫胺素（2mg/ml），过滤灭菌
1.0 ml

Min Man Salts I
10.0 ml

Min Man Salts II
10.0 ml

闵曼盐

每1 L
集中

K _{2 HPO ₄} 100克
574.12 mM

KH ₂ PO ₄
100克
734.8 mM

Na _{2 ₄} 25克
174.8 mM

d H 2 O 2 1 L

闵曼盐II

每1 L
集中

FeCl 3 ^。 6H <2> O
1.0 g
3.7 mM

浓HCl
调节pH至〜7.0（〜1滴）

CaCl 2 ^。 2H O
10.0克
68 mM

MgCl 2 ^。 6H <2> O
25.0克
123 mM

d H 2 O 2 1 L

高压灭菌器

提取缓冲区
100mM甲酸铵 100mM甲酸
25％甲醇

HPLC流动相
100mM甲酸铵 100mM甲酸
25％甲醇
对于1升提取缓冲液/流动相，按以下顺序添加以下组分。添加所有组分后混匀。

550 ml
水

100 ml
甲酸铵，1M，通过0.22μm过滤器过滤

100 ml
甲酸，纯度≥98％，1M/B

250 ml
甲醇，HPLC级

致谢

该方案得自Yurgel等人，2014年。该工作得到华盛顿州立大学的农业研究中心（WNP-00773）的支持，并授予DE-FG0396ER20225 Vol。 27，No.5,2014/445，来自美国能源部的能源生物科学计划，并授予NSF-MCB 1052492给S.Rajamani。这项活动资助了一部分来自农业部的新兴研究问题内部竞争性拨款华盛顿州立大学农业，人类和自然资源科学与生物密集型农业和有机耕作学院（BIOAg）的研究中心。华盛顿州立大学维持农业和自然资源中心（CSANR）的内部竞争性资助。 Yurgel。我们感谢M. Kahn的讨论和华盛顿州立大学生物技术和生物分析实验室的测序支持。

参考文献

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