材料和试剂

< em>丁香假单胞菌（< em>丁香水杨）Lz4W菌株（Shivaji等人，1989）
大肠杆菌（大肠杆菌）DH5α菌株
随机引物标记试剂盒（JONAKI Laboratory，目录号：LCK 2）
注意：许多公司如Roche Diagnostics，Thermo Fisher Scientific，Agilent，Clontech等都提供类似的工具包。
Wizard基因组DNA纯化试剂盒（Promega Corporation，目录号：A1120）
（Alpha <32> P）-dATP（JONAKI Laboratory，目录号：LCP 103）
溶菌酶（Roche Diagnostics，目录号：10153516103）
10％三氯乙酸（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：T6399）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
50mM Tris（pH7.5）
10％蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
蛋白胨（HiMedia Laboratories，目录号：RM 001-500G）
酵母提取物（HiMedia Laboratories，目录号：RM 027-500G）
停止缓冲区（参见配方）
溶菌酶溶液（参见配方）
ABM肉汤（Pavankumar等人，2010）（参见Recipes）

设备

BD PrecisionGlide针22G（BD，目录号：305156）
液体闪烁分析仪（PerkinElmer，型号：Tri-Carb 2900 TR）
离心机（Eppendorf，型号：5810R，目录号：5811000.010）
NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号8482）
微量离心管（1.5ml）（tarsons，目录号：500010）
F12-ED制冷/加热循环器（JULABO GmbH，目录号：9116612）
塑料闪烁瓶（PerkinElmer，目录号：6000477）
使用适当的指南分离放射性工作的实验室设计和工作空间

程序

细胞提取物的制备
细胞提取物制备的基本方法改编自早期描述的方法（Wickner等人，1972; Villani等人，1978）。
1. 接种 P。（在25ml烧瓶中高压灭菌）中的单个菌落（在ABM琼脂平板上划线并在22℃下温育24-36小时）中培养大肠杆菌Lz4W菌株。在22℃下以200rpm振荡生长过夜。
2. 使用过夜生长的培养物接种物在新的20ml ABM肉汤（在100ml烧瓶中高压灭菌）中以1：100比例稀释度接种新鲜的次级培养物，并在22℃下生长直至指数生长期（OD <600μm） >〜0.3〜0.4，生长6-7小时）
3. 通过在22℃下以10,000rpm离心5分钟沉淀细胞
4. 弃去上清液，用1ml含有10％含有50mM Tris-盐酸（pH7.5）的蔗糖的缓冲液洗涤沉淀。在室温（22-25℃）下，将0.002体积（40μl，对于20ml培养物）的10％蔗糖重悬于含有50mM Tris缓冲液（pH7.5）的沉淀中。
5. 加入1/10体积（4μl）溶菌酶溶液和0.025体积（1μl）4M KCl。在0℃（在冰上）孵育混合物30分钟。
6. 在2℃下以14,000rpm离心裂解物45分钟
7. 将上清液转移到新鲜的微量离心管中并在0℃（在冰上）储存。使用NanoDrop 1000分光光度计量化总蛋白浓度。
  注意：虽然这种细胞裂解物在冰上稳定几个小时，但在我们的大多数实验中，我们在制备的30-60分钟内使用这种新鲜制备的裂解物。
模板DNA（大肠杆菌基因组DNA）的制备
1. 使用基因组DNA分离试剂盒从大肠杆菌菌株MC4100分离基因组DNA 注意：这个步骤要在准备假单胞菌细胞提取物前一天进行。
2. 通过使其通过大规格（22G）针几次（15-16次以获得6-10kb大小的剪切的DNA）剪切基因组DNA。
3. 通过在NanoDrop 1000分光光度计中读取读数来确定DNA的浓度
4. 通过在沸水浴中孵育2-3分钟来使模板DNA变性，然后立即将其冻结到冰水浴中。该DNA将用作模板，以使用任何革兰氏阴性细菌细胞提取物测定DNA聚合活性
DNA聚合活性测定
1. 在所需温度下预温育假单胞菌细胞裂解物的等分试样10分钟。我们对于P使用22℃和4℃。丁香液细胞提取物
2. 制备两种测定混合物（实验）的复制品（2至3）：一组在22℃下培养，另一组在4℃下培养。
3. 每种测定混合物（50μl）将具有1μg热变性模板DNA（剪切的大肠杆菌基因组DNA），随机引物缓冲液（1x），随机六核苷酸引物（1x），每种0.8mM dCTP，dGTP，dTTP和40μCi的[α-32P] -dATP。在实验温度（22℃和4℃）预孵育样品至少5分钟。
  注意：使用无菌Milli-Q水调节反应体积，考虑要添加的细胞提取物的体积，使最终体积为50μl。
4. 准备另外两套测定混合物作为对照，并如上所述进行处理。对照（阴性）测定混合物将具有除模板DNA之外的所有物质。
5. 同时，标记用于在不同时间点收集反应样品的管。例如，对于6个时间点，对于每个测定混合物取6个微量离心管，并将其标记为0,15,30,60,90和120秒。加入30微升的E。大肠杆菌未标记的变性DNA（50μg）在终止缓冲液中，并将40μl10％TCA加入每个管中作为终止缓冲液注意：
  1. <大肠杆菌未标记的变性DNA（冷DNA）的添加增加了标记的DNA（热DNA）的沉淀效率。
  2. 冷的DNA从大肠杆菌生长的细胞中分离，热变性并立即转移到冰水中。
6. 现在，为了开始实验，将100μg预孵育的细胞裂解物加入在22℃和4℃孵育的测定混合物（步骤C4）中。
7. 从不同的时间间隔（0,15,30,60,90和120秒）从每个测定管中取出10微升等分试样，通过加入相应的标记管停止反应。
8. 在0℃下孵育这些管1小时以沉淀标记的DNA，然后在4℃下以14,000rpm离心15分钟。
9. 从含有未掺入标记物的试管中除去上清液。为了除去药物，将管倒入薄纸或吸墨纸上2-3分钟。
10. 将离心管放入塑料闪烁瓶中，直接测量放射性，而不在闪烁计数器中加入任何闪烁液（cherenkov计数）。
11. 从实验值中减去对照的值（CPM），并计算放射性掺入率。
12. 放射性（每分钟计数或CPM）或DNA聚合速率可以表示为细胞提取物中每毫克蛋白质的每分钟CPM。

在0℃下孵育这些管1小时以沉淀标记的DNA，然后在4℃下以14,000rpm离心15分钟。

从含有未掺入标记物的试管中除去上清液。为了除去药物，将管倒入薄纸或吸墨纸上2-3分钟。

将离心管放入塑料闪烁瓶中，直接测量放射性，而不在闪烁计数器中加入任何闪烁液（cherenkov计数）。

从实验值中减去对照的值（CPM），并计算放射性掺入率。

放射性（每分钟计数或CPM）或DNA聚合速率可以表示为细胞提取物中每毫克蛋白质的每分钟CPM。

...

Lysozyme solution
2 mg/ml in 0.025 M Tris^.HCl (pH 7.6)

ABM media
0.5% peptone
0.2% yeast extracts

Acknowledgments

The basic method of cell extracts preparation was adapted from methods described earlier (Wickner et al., 1972; Villani et al., 1978). The work was financed by a Grant from the Department of Science and Technology (DST), and by the Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Government of India.

参考文献

Pavankumar，T.L.，Sinha，A.K.and Ray，M.K。（2010）。 RecBCD酶的所有三个亚基都是对于南极假单胞菌（Pseudomonas syringae）Ls4W的DNA修复和低温生长至关重要。

5（2）：e9412。
Sinha，A.K.，Pavankumar，T.L.，Kamisetty，S.，Mittal，P.and Ray，M.K。（2013）。复制停止是南极地区低温生长的主要威胁伪狂犬病毒/em> Lz4W。 Mol Microbiol 89（4）：792-810。
Shivaji，S.，Rao，N.S.，Saisree，L.，Sheth，V.，Reddy，G.S。和Bhargava，P.M。（1989）。假单胞菌的分离和鉴定。从，Appl。Environ Microbiol 55（3）：767-770。
Villani，G.，Boiteux，S。和Radman，M。（1978）。紫外线诱导诱变的机制：体外细胞的程度和保真度 DNA在辐射模板上的合成。美国国家科学院院刊75（7）：3037-3041。
Wickner，R.B.，Wright，M.，Wickner，S。和Hurwitz，J。（1972）。将phiX174和fd单链DNA转化为大肠杆菌提取物中的复制型/em>。美国国家科学院院报69（11）：3233-3237。