材料和试剂

VZV允许的人细胞（例如MeWo细胞）（ATCC，目录号：HTB-65）
含有Earle's BBS，含L-谷氨酰胺的最小必需培养基（Lonza，目录号：12-611F）
胎牛血清（FBS）（LabTech，目录号：FCS-SA-10454）
青霉素：链霉素（每种5,000单位/ml）（Lonza，目录号：DE17-603E）
非必需氨基酸（NEAA）（Life Technologies，目录号：11140035）
1x胰蛋白酶-EDTA液体（0.05％胰蛋白酶，0.53mM EDTA-4Na）（Life Technologies，目录号：25300096）
不含镁或钙的磷酸盐缓冲盐水（Lonza，目录号：17-516F）
重组VZV-GFP细胞相关病毒原种（Zerboni，2000）
MeWo生长培养基（参见食谱）

设备

75cm 2过滤盖组织培养烧瓶（Sigma-Aldrich，目录号：C7106-120EA）中。
96孔黑色组织培养处理板（48 /箱）（VWR International，目录号：734-1609）
50ml离心管（例如，Corning，目录号：430290）
一次性血细胞计数器（KOVA Glasstic slide 10 with counting grid）（HYCOR Biomedical，目录号：87144E）
荧光板读数器（例如 POLARstar OPTIMA，BMG LABTECH）
II类微生物安全柜
加湿的细胞培养孵育器（37℃，5％CO 2）
移液器辅助（Alpha实验室，目录号：4-131-201-E）
离心机（例如：Eppendorf，目录号：5811-000.010）
光学显微镜

程序

取半天汇合（约50％）T75烧瓶的MeWo细胞，前一天已分裂（见注1）。
取出培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗，弃去洗液
通过加入3毫升胰蛋白酶排除细胞。在37℃孵育约5分钟或直到细胞完全移动
通过加入7ml MeWo生长培养基来灭活胰蛋白酶
移液器上下移动以产生单细胞悬浮液。
去除12微升，并在一次性血细胞计数器中计数细胞密度
在MeWo生长培养基中将细胞稀释至2×10 5个细胞/ml的密度，在黑色平底96孔板中每孔加入100μl种子，得到2×10 4个细胞/孔（见注2）
使细胞在37℃下在具有5％CO 2的潮湿培养箱中粘附过夜。
从液氮存储中取出一瓶已知滴度的VZV-GFP，立即在37℃的水浴中解冻，直到解冻（见注3）。
将解冻的细胞转移到50ml离心管中，并逐滴缓慢加入30ml生长培养基（预热至37℃）逐渐增加细胞的温度。
在200×g离心10分钟以沉淀细胞
轻轻取出整个洗涤介质，并重悬于1ml生长培养基中
在足够的生长培养基中稀释细胞，产生1000 IU/ml（见注4）
从培养箱中取出培养板，通过倒置培养板并在合适的消毒剂容器上摇动来除去培养基
向每个待感染的孔中加入100μl经洗涤和重悬的VZV-GFP细胞接种物，并向未感染的对照孔中加入100μl生长培养基（参见注释5）。
更换板上的盖子，并将板放回培养箱。监测病毒复制，作为感染后〜22小时至复制平台期间GFP荧光的量度（见注6）。
为了比较未处理和处理的细胞中的病毒复制（蛋白质过表达，基因耗竭，药物处理等），计算在线性生长期的复制倾向，并将处理的细胞标准化为未处理的（"正常"复制;图1）。

图1.复制斜率的计算。A.作为GFP荧光的函数，在多轮复制中监测病毒生长。 B.将感染后模拟转染和阳性对照（IDE，VZV的细胞受体; ORF28，VZV的DNA聚合酶）细胞的相对荧光单位相对于感染后的小时绘图以产生生长曲线。 C.在Excel中使用线性方程计算复制对生长的线性阶段的斜率，并相对于对照（模拟）转染的细胞标准化。 D.在条形图中比较复制斜率，以观察siRNA基因耗尽对VZV复制的影响。

笔记

病毒复制在接种到测定板之前新鲜传代的细胞中更有效地进行
使用黑色测定板有助于减少孔之间的背景和串扰
当在培养物中生长时，VZV病毒颗粒保持与细胞膜结合。因此，VZV感染的MeWo细胞用作VZV复制测定的接种物。这些细胞储存在液氮中，需要在使用前解冻和洗涤。细胞对温度变化非常敏感。当解冻时，它们必须在37℃下快速解冻，直到仅仅解冻（1-2分钟）。不要将细胞留在更长的时间，因为这将大大降低细胞活力，因此降低复制能力的病毒的滴度。
用已知量的病毒（感染复数; MOI）进行感染以在合理的时间尺度上产生生长曲线是重要的。通过标准噬菌斑测定法测定VZV-GFP感染的MeWo细胞的滴度[每ml病毒的感染单位数（IU/ml）]，其中将病毒原种加入Mewo细胞单层并用琼脂糖覆盖。这导致仅感染相邻细胞，其随后死亡以在细胞单层内留下空补片。可以计数这些斑块或"噬菌斑"以将病毒定量为每ml接种物的"噬斑形成单位"或感染单位（IU）。根据我们的经验，96孔板的每孔100IU产生用于复制分析和比较的合适的生长曲线。例如，滴度为6.6×10 4 U/IU/ml的病毒原液将在100μl中含有6,600IU。因此，1ml等分的病毒接种物应重悬于66ml培养基中
组织培养塑料制品，细胞和生长培养基都具有一定程度的荧光。当使用荧光报告基因时，因此必须具有适当的对照以提供背景荧光读数。对于该测定，将来自模拟感染细胞的荧光用作背景
在规则的时间间隔上监测复制以使得能够绘制完整的生长曲线（随时间的荧光）。当比较未处理和处理的样品之间的VZV复制时，我们使用在线性生长期的复制的斜率。因此，重要的是在该相位上尽可能多地进行测量（对于斜率计算的统计可靠性，具有最小值6）。使用您自己的设备进行的测试复制测定将允许建立线性生长的时间，并且可以调整测定时间以确保在这段时间内进行测量。

食谱

MeWo生长培养基
鹰的最低必需培养基（EMEM）
5％FCS
1％p-s
1％NEAA

致谢

我们感谢安阿文教授（斯坦福医学院）的VZV-GFP克隆的恩赐，并感谢博士Armin Baiker传播细胞相关的VZV-GFP病毒股票。该方案由Lakshmi N. Kaza博士和Samantha Griffiths博士进行了优化。作者衷心感谢MRC的资助（G0501453 J.H.）。

参考文献

von Bokay，J。（1909）。 UëberdenaëtiologischenZusammenhang der Varizellen mit gewissenFällenvon Herpes Zoster。 Wien Klin Wochenschr 22：1323-1326。
Zerboni，L.，Sommer，M.，Ware，C.F.and Arvin，A.M。（2000）。人类CD4阳性T细胞系的水痘带状疱疹病毒感染。 em> Virology 270（2）：278-285