材料和试剂

在 E中表示 Tt 大肠杆菌KRX
1. 大肠杆菌KRX（Promega公司，目录）的甘油原液 number：L3002 ）[编码在a。控制下的T7RNA聚合酶基因鼠李糖启动子]，用质粒pRARE（EMD Millipore， Rosetta （DE3）感受态细胞，目录号：70954-3 [编码用于稀有密码子的tRNA以增强蛋白质翻译效率]和pWUR702 [pCDF-1b衍生物，具有T。嗜热链球菌 HB27 TT_P0026 基因插入片段融合至N端链霉亲和素（II）在IPTG诱导型T7启动子控制下的表达]（Addgene，目录号：53079 ）。
  注意：质粒pWUR703（Addgene，目录编号：53082）可用于表达TtAgoDM（双突变体， D478A，D546A）这种蛋白质的表达和纯化是相同的到TtAgo的表达和纯化。
2. 1000x氯霉素溶液（34mg/ml）溶于100％乙醇中
3. 溶解于MilliQ H 2 O中的1,000x链霉素溶液（50mg/ml）
4. 20％D-葡萄糖溶液溶解在MilliQ H 2 O（无菌过滤）中
5. 溶解在MilliQ H 2 O中的20％L-鼠李糖溶液（无菌过滤）
6. 溶解在MilliQ H 2 O（无菌过滤）中的1M IPTG
7. LB培养基（参见配方）
净化 Tt Ago
1. 来自o/n tAgo表达式的细胞沉淀（见上文）
2. Strep-Tactin Sepharose 50％悬浮液（IBA，目录号：2-1201-XXX）
3. 1.2ml Bio-Spin色谱柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：732-6008）
4. 缓冲区I（参见配方）
5. 缓冲液II（参见配方）
6. 缓冲液III（参见配方）

设备

在 E中表示 Tt 大肠杆菌KRX
1. 50ml Greiner管
2. 2.5升锥形瓶
3. 离心机
4. 37℃摇床培养箱
5. 20℃摇床培养箱
6. 冰水浴（水和冰混合）
净化 Tt Ago
1. 法语压力机，超声波仪或等效物对细胞破裂
2. 离心机

程序

在大肠杆菌 KRX中表达 Tt
1. 取10ml 50ml LB培养基在50ml Greiner管中
2. 加入10μl1000x氯霉素溶液
3. 加入10μl1,000x链霉素溶液
4. 加入200μl20％D-葡萄糖溶液
5. 使用无菌吸头从甘油原液接种培养物
6. 在37℃下，在振荡培养箱中以180rpm培养o/n
7. 在o/n温育后，在室温下以4000xg离心培养10分钟。
8. 除去上清液以去除任何痕量的D-葡萄糖 - 这是重要的作为D-葡萄糖痕迹可以防止L-鼠李糖吸收（和从而抑制 Tt Ago表达）。
9. 重悬细胞沉淀在1ml LB培养基。
10. 取含有1 L LB培养基的2.5升锥形瓶
11. 加入1ml 1000x氯霉素溶液
12. 加入1ml 1,000x链霉素溶液
13. 添加重悬细胞。
14. 在37℃下在振荡培养箱中以140rpm孵育培养物
15. 监测培养物的OD 600nm。如果OD 600nm 0.7-0.8是达到（这需要〜3-4小时），将培养物转移到冰水浴中冷冻15分钟。这一步骤减缓了E的代谢。大肠杆菌并触发冷激蛋白的表达，这可能有助于Tt Ago 折叠在表达期间。
16. 向培养物中加入1ml 1M IPTG和5ml 20％L-鼠李糖溶液以诱导表达。
17. 将培养物转移到20℃摇床培养箱中，以140rpm转移o/n（+/- 16h）表达
18. 通过在4℃下以6,000xg离心培养物15分钟收获细胞。
19. 除去上清液。你通常最终会有4-5克的细胞沉淀。
净化 Tt Ago
1. 如果使用French Press进行细胞裂解：在缓冲液I中重悬细胞沉淀（每克细胞沉淀5ml缓冲液I），并通过细胞悬浮液通过法语挤压两次，在16,000psi（见注c）。
  如果使用a 用于细胞裂解的超声器：将细胞沉淀重悬于缓冲液I（每克细胞沉淀3ml缓冲液I），并通过超声处理裂解细胞。使用适用于大体积细胞裂解的尖端和声处理方案悬浮液。
2. 在4℃下以30,000×g离心30分钟
3. 将上清液（无细胞提取物）转移到干净的试管中
4. 准备一个Strep-Tactin琼脂糖柱通过加载500微升的50％悬浮于1.2ml Bio-Spin层析柱（最终柱体积为250μl）
5. 通过用500μl缓冲液I装载柱三次来洗涤柱
6. 将无细胞提取液装入色谱柱。
7. 通过用750μl缓冲液I装载其三次来洗涤柱
8. 通过用750μl缓冲液II装载其三次来洗涤柱
9. 洗脱蛋白质通过加载250μL缓冲液的列三次三，收集流经。 Tt Ago洗脱的典型产率级分对于级分1和3以及在5-10中在0-2.5μM范围内 μM范围。部分2.Tt AgoDM的典型产率在0-2.5μM 范围为级分1和3，在2.5-7.5μM范围内为级分2.
  注意：
  1. 根据实验，MgCl ₂ 和MnCl ₂ 浓度可以降低至0.5mM，或省略。 NaCl浓度可以降低至0.5 M，但是， Ago（尤其是在较高的蛋白质浓度下）更多在1M NaCl下稳定。在较低浓度盐（特别是波纹管250 mM），在高于5μM的蛋白质浓度下，Ago不稳定。）
  2. 上述协议描述了无指导的 Tt ago的净化。如果指导共纯化是需要的，更换所有缓冲液I在此实验用缓冲液II。
  3. 使用法式压力传感器或超声波仪给出或多或少相同的产量 - Tt Ago非常稳定，很少甚至没有蛋白质将在超声处理期间损失。记住然而，超声处理通常不太适合大体积，和适合于裂解大体积细胞悬浮液的方案应该应用。

代表数据

图1. Tt Ago（左）和的考马斯亮蓝染色的12％SDS-PAGE凝胶 > Tt AgoDM（右）纯化样品。 M：Bio-Rad精密加蛋白标记。标记带大小以kDa表示。 FT：柱流过装载的无细胞提取物的部分。 W1：具有缓冲液I的柱洗级分。W2：具有缓冲液II的柱洗级分。 EL1-EL3：洗脱级分1-3。蛋白质显示为具有+/- 75kDa大小的带。

食谱

LB培养基（1L）
10g胰蛋白胨
5g酵母提取物
10克NaCl
用demiwater填充1升
用NaOH将pH设定为7.5
缓冲区I
20mM Tris-HCl（pH8）
1 M NaCl
2mM MgCl 2/
缓冲区II
20mM Tris-HCl（pH8）
1 M NaCl
2mM MnCl 2
缓冲区III
20mM Tris-HCl（pH8）
1 M NaCl
2mM MnCl 2
2.5mM生物素注意：生物素可以用d-Desthiobiotin替换，这将允许柱再生。

致谢

这项工作得到了荷兰科学研究组织（NWO）授予J.v.d.O的资助。（NWO-TOP，854.10.003）。

参考文献

Swarts，DC，Jore，MM，Westra，ER，Zhu，Y.，Janssen，JH，Snijders，AP，Wang，Y.，Patel，DJ，Berenguer，J.，Brouns，SJand van der Oost， 2014）。由原核生物Argonaute进行的DNA引导的DNA干扰。自然 507（7491）：258-261。