材料和方法

Hypoxyprobe ^TM -1 Plus Kit（Hypoxyprobe ^TM，目录号：HP1-1000Kit）
在Hypoxyprobe ^{TM Plus Plus试剂盒（Hypoxyprobe ^TM，目录号：HP1-1000Kit）中包含兔，FITC缀合的第二试剂。}
氯化钠ACS试剂（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
Milli Q H sub 2 O 2 /
Corning瓶顶真空过滤系统（Sigma-Aldrich，目录号：CLS430769）
PBS（Sigma-Aldrich，目录号：P-4417）
抗CD31抗体（Dianova GmbH，目录号：DIA-310）
抗Meca32抗体（Abcam，目录号：ab27853）
抗Endomucin抗体（Millipore，目录号：MAB2624）
Cy3缀合的第二IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories）
Tissue-Tek OCT化合物（Ted Pella，目录号：27050）
液氮
IsoFlo（异氟烷，USP）（Abbott Laboratories，目录号：05260-05）
二氧化碳（Sigma-Aldrich，目录号：295108-227G）
超级霜加; 白色显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-550-15）
液体闪烁小瓶，塑料（Sigma-Aldrich，目录号：M2026-1000EA）
长寿黄金防褪色填充剂（Life Technologies，目录号：P10144）
Aqua Block/EIA/WB（EastCoast Bio，目录号：PP82）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：320110）
微型保护玻璃，矩形，1号（VWR国际，目录号：48393-106）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416-50ML）
0.9％盐水（见配方）
30mg/ml哌莫硝唑在0.9％盐水中（见Recipes）
抗体稀释剂（参见配方）
20％水块（见配方）
PBS-t（参见配方）

设备

低温恒温器（Leica，目录号：CM3050S）
薄型切片机刀片（Accu Edge，目录号：4689）
手术设备（Braintree Scientific）
荧光或明视场显微镜（Nikon Eclipse，型号：E600）
荧光显微镜相机（Photometrics，Cool Snap HQ）
尼康过滤器（FITC：96170M F HQ，Cy3/TRITC：96171M R HG，DAPI /核：96101M UV-2E/C）
30G×1/2英寸精密滑动针（BD Biosciences，目录号：305106）
仅结核菌素注射器（BD Biosciences，目录号：309659）
小鼠尾部限制器（Braintree Scientific，目录号：TV-150STD）

软件

NIS Elements软件，ImageJ（开源软件： http://imagej.nih.gov/ij/ ）或其他图像分析软件

程序

以下程序测量荷瘤小鼠中的缺氧，并且可以在动物实验的任何相应终点使用。

将Hypoxyprobe TM sup（盐酸哌莫硝唑）以30mg/ml的浓度在0.9％无菌盐水中重悬浮。
多个小鼠（每组n = 5对于统计学相关性是最佳的）用60mg/kg的咪蒙唑溶液静脉内（尾静脉）注射。

图1.尾静脉注射方案。1.获得Tailveiner Restrainer。 2。插入鼠标并按下限制器，将鼠标置于位置。 < u> 3。将尾部旋转45度，以找到并用针注射尾静脉。 4。尾静脉注射的近端表示。 5。血液的出现验证了成功的尾静脉注射。
在小鼠用异氟烷或二氧化碳安乐死前（CO 2），在体内循环90分钟。
注意：对于动物安乐死：根据适当的IACUC方案，将动物置于滴剂罐或蒸发器中，在控制浓度的异氟烷或CO 2气体存在下，，以确保正确吸入。然后通过颈部脱臼的第二种方法处死动物。
然后取出器官，称重，快速冷冻，并在-80℃下储存在塑料闪烁瓶中。
注意：哌莫硝唑染色可用于石蜡包埋的组织，冷冻组织和细胞系。
然后将器官从闪烁瓶中取出，包埋在OCT中，置于低温恒温器中，切成10μm厚的切片。将切片置于显微镜载玻片上用于染色。
注意：
低温恒温器设置
1. 使用的温度范围可以是-10至-50℃，取决于组织类型，虽然-20°C推荐用于大多数组织。
2. 在"修剪模式"（切割5 - 150μm）和"切割"之间切换模式"（0.5-50μm），以便调整组织的开始节集合。
3. 切片的速度取决于研究者自己的速度。
5. 为了实现样品的适当表示，切割组织的非连续部分。
然后用FITC缀合的抗咪莫唑一抗（包含在试剂盒中）和内皮细胞标记（CD31，Meca-32或内皮抑制素），然后用各自的Cy3-缀合的第二IgG来探查冷冻的组织切片。使用仅用抗体稀释剂作为其一抗作为阴性对照孵育的载玻片。
1. Hypoxyprobe™-1 Plus Kit建议稀释1:50 - 100 二抗兔抗FITC辣根过氧化物酶偶联抗体。
2. 对于其他一抗，推荐1:50 - 1：100稀释，除非各自的一抗数据表另有规定注意：
  1. 可以使用任何适当标记的二抗FITC抗体将结合于咪达唑加合物中的缺氧细胞内组织。
  2. 这种染色应在收获器官的一周内完成，因为信号将开始褪色。
  3. 动物组织内缺氧的询问不限于荧光染色，因为它可以用棕色染色（DAB）进行。可以利用相应的一级和二级抗体来实现两种类型的染色。
冷冻切片的荧光组织染色方案的实施例：
1. 风干冻结的滑梯。
2. 用丙酮固定幻灯片30秒-2分钟。
3. 短暂空气干燥几秒钟（不要让组织完全干燥）。
4. 用PBS-t进行两次水合切片，每次5分钟注意：一旦组织再水化，不要让幻灯片变干。
5. 阻止在您最喜欢的封锁解决方案（通常20％的水溶性块在PBS）10 - 30分钟
6. 倒出封闭溶液，加入一抗，在室温下孵育1小时，在4℃过夜
7. 用PBS-t洗涤载玻片3次，每次5分钟
8. 在室温下用二抗孵育载玻片1小时
9. 用PBS-t洗涤4次，每次5分钟
10. 用延长的金色安装溶液和盖玻片安装载玻片
11. 沿着盖玻片的边缘涂抹密封剂（例如清除指甲油），以保留幻灯片。
12. 对幻灯片进行映像。
然后根据需要使用20x或40x显微镜放大获得组织切片的成像，并使用NIS Elements软件或ImageJ（开源软件）进行分析。
注意：
1. 显微镜上的滤光片应包括用于荧光显微镜的以下波长：
  1. FITC（绿色470-520 nm）
  2. Cy3/TRITC（红色530-570 nm）
  3. DAPI/nuclei（蓝色345-455 nm）
2. 为了每个组织区域建议六到八个图像在广泛的代表性样本中捕获可变信号强度相应的组织。
3. 阴性对照从步骤6滑动应该用作后台控件。用图像分析软件，一旦"背景"的阈值被计算使用这个阈值以对剩余部分成像，并最终将它们标准化到此阈值以消除背景。

代表数据

图2.代表性数据（取自参考文献1）。将6周龄的KIC小鼠用盐水或mcr84处理1周。哌莫硝唑注射后1小时处死动物（i.v.）。组织对内皮细胞（MECA32，红色）和哌莫硝唑加合物（Hypoxyprobe，绿色）染色。缺氧区域被量化并且呈现在右边。误差棒：* P <0.05，使用Tukey多重比较检验的单因素方差分析。每个处理组切割6只动物的胰腺，测定每个器官的平均强度值，并且平均强度并计算SEM。有关代表性数据的模型和上下文的更多信息，请查看此参考

图3.代表性数据（取自Aguilera等人，2014）。使用抗体，FITC缀合的小鼠抗哌莫硝唑对肿瘤内缺氧的量进行定量，针对当Hypoxyprobe-1进入缺氧组织时形成的加合物。定量阈面积的百分比，并通过归一化到来自Sparc +/+小鼠的数据来组合两个单独的实验。图像显示在肿瘤内用鼠抗鼠内皮细胞（Meca-32）抗体染色的脉管系统附近的缺氧（绿色）（红色）。用DAPI（蓝色）标记核。误差条：* P <0.05，学生t检验。有关代表数据的模型和上下文的更多信息，请查看此参考。

来自我们实验的代表性数据公开在Aguilera等人（2014），Arnold等人中。（2010），Cenik等人。（2013）和Ostapoff等人。（2013）。
荷瘤模型中的其他代表性数据可以在Graves等人中找到。（2010），以及关于建立该测定的背景信息可以在Raleigh等人中找到。（1998）使用哌莫硝唑作为缺氧的标志物。

食谱

0.9％盐水
将0.9克氯化钠（NaCl）在100ml milli Q H 2 O中混合过滤
30mg/ml哌莫硝唑的0.9％盐水溶液
30mg哌莫硝唑在1ml过滤的0.9％盐水中
抗体稀释剂（除非在Hypoxyprobe ^TM -1 Plus试剂盒中另有规定）
5％BSA的PBS溶液
20％水性块
在80ml PBS中的20ml水性块
PBS-t
200μl吐温20在99.8ml PBS中的溶液

致谢

博士。 Bercin Kutluk Cenik和Shanna Arnold提供关于该测定的信息，Miao Wang博士用于尾静脉注射方法，以及Michael Dellinger博士用于冷冻玻片染色方案。这项工作部分由Affitech AS（RAB），NIH（R01CA118240至RAB; F31CA168350至KYA; U01CA141576和R01CA137181至DHC）和Effie Marie Cain血管生成研究奖学金（RAB）的赞助研究协议部分支持。

参考文献

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