材料和试剂

如下所述对来自C57BL6J怀孕小鼠（2-4个月大）的E13胚胎进行电穿孔。按照西班牙语（RD 223/88），欧洲（86/609/ECC）和美国（国家研究委员会，1996）规定收集和处理动物。
质粒Midi试剂盒（Roche，目录号：03143414001）（例如Genopure Plasmid Midi Kit）
快速绿FCF（Sigma-Aldrich，目录号：F7252）
无菌水
异氟烷（Abbott Laboratories，目录号：880393.4）
无菌盐水（见配方）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）

设备

硼硅玻璃毛细管（World Precision Instruments，目录号：1B100F-4）
微量吸管（Sutter Instrument，型号：P36）
抽吸管组件（Sigma-Aldrich，目录号：A5177-5EA）
黑色编织丝3/0（LorcaMarínS.A.Ctra，目录号：55159）
无菌纱布和棉签（Aposan，目录号：343160.6）
解剖工具（图1C）
1. 环钳（Karl Hammacher GmbH，目录号：HSC703-96）
2. 锯齿钳（Fine Science Tools，目录号：11101-09）
3. 镊子（Fine Science Tools，目录号：91150-20
4. 精细剪刀（Fine Science Tools，目录号：14094-11）
解剖显微镜（Leica Microsystems，型号：MZ125）和光纤灯（LEICA KL 2500 LCD）
平方电穿孔仪（BTX The Electroporation Experts，型号：ECM830）
发电机脚踏开关（BTX The Electroporation Experts，型号：1250FS）
铂板镊子型电极（Nepa基因，型号：CUY650P5）
异氟烷蒸发器（Surgivet ，Smiths Medical，型号：100）

程序

DNA制备
1. 使用商业试剂盒（例如 Genopure Plasmid Midi Kit）制备质粒。
2. 在无菌水中稀释DNA至终浓度为1μg/μl。加 1/10体积的0.1％快速绿色水溶液加入到DNA溶液中。一个总体积5-10微升将足以电穿孔八胚胎。
微量移液器的制备
1. 用Micropipette拉杆拉动硼硅玻璃毛细管。推荐的拔轮器设置如下：774热; 100拉和1 时间（这些参数可根据拔出器而变化）。
2. 使用镊子在1 - 2厘米（图1A）切割吸管的尖端。
  注意：图1显示了一个新面板，分别说明了移液器的初始和最终形状，从左到右。
电穿孔。
1. 对于E13胚胎和指示的电穿孔仪，以下设置推荐：38 V的五个脉冲，每个50 ms，间隔950 ms。对于E14胚胎，推荐设置为48 V，50 ms的五个脉冲每个，间隔950 ms。
  注意：RGC的产生发生在E13; 因此在此阶段进行电穿孔。
2. 吸出DNA混合物，以填充提取的微量移液管的尖端（图1B）。用异氟烷麻醉怀孕小鼠。
3. 将麻醉的小鼠腹部放在工作台上，并用异氟烷蒸发器在鼻子上放置一个面具。
4. 用乙醇或聚维酮碘洗腹部。执行a 纵向切口约2厘米，在腹部中部使用a 精细剪刀（图1C）。
  
  图1.玻璃移液管的形状前后A。抽吸管和玻璃毛细管与DNA 混合物B和解剖工具C.
5. 放置棉签浸泡在预温的盐水中37°C保持在腹部组织湿润，避免器官意外损伤，抢两者角的子宫与两个棉签，轻轻地将它们放在上面无菌纱布（图2A）。
6. 用一个戒指握住胚胎镊子在一只手，确保你有一个侧视图，所以可以容易地识别眼睛。使用色素小鼠品系方便程序（如C57BL6J）。用另一只手握住嘴移液器。用移液管摘取子宫并引入尖端的预填充移液器进入眼睛（小心不要通过透镜），并将DNA溶液轻轻地吹入眼睛（图2B）。
7. 将电极放置在子宫的左右两侧胚胎头只是在中间。正极必须放置在注射的眼睛的侧面并覆盖所有它（见箭头在图2C）。应用电脉冲并执行相同操作程序与以下胚胎。
8. 一旦所有的胚胎都被电穿孔，将子宫角放回小鼠腹腔。
9. 缝合切口，并将怀孕的水坝更换为笼子。让胚胎发育到所需的阶段（图2D）。
10. 电极可以放置在眼睛的几个角度电穿孔的不同视网膜结构域（实施例显示于图2E）
  
  图 2.麻醉的怀孕小鼠胚胎在棉花上面拭子A。注射到胚胎的眼睛B.的位置子宫壁上的电极（箭头指示眼睛）C. 缝合腹腔D. 该图表示几个位置电极。平面视网膜以绿色不同的方式示出电穿孔结构域，中枢，鼻和颞E。

代表数据

这个协议是有用的，以确定在胚胎视网膜基因操作的影响（图3）。

图3.用GFP质粒A电穿孔的平顶视网膜概述。视神经（ON），视交叉（OC）和视神经中的绿色标记的轴突（OT）B.视盘C和电穿孔的视网膜细胞D.的放大率

食谱

盐溶液
将9g NaCl溶于1L蒸馏水和高压釜中

致谢

我们要感谢Paola Bovolenta的支持和批判性阅读。我们感谢Eloisa Herrera和Cristina Garcia-Frigola修改的协议。

参考文献

Garcia-Frigola，C.，Carreres，M.I.，Vegar，C.and Herrera，E。（2007）。通过子宫内电穿孔将基因递送到小鼠视网膜神经节细胞中。 a> BMC Dev Biol 7（1）：103.
Petros，T.J.，Rebsam，A.and Mason，C.A。（2009）。在子宫内和离体电穿孔小鼠视网膜神经节细胞中的基因表达。（31），e1333。
Sánchez-Arrones，L.，Nieto-Lopez，F.，Sánchez-Camacho，C.，Carreres，M.I。，Herrera，E.，Okada，A.and Bovolenta，P.（2013）。 Shh/Boc信号传导是在小鼠视网膜中持续产生同侧突出的神经节细胞所必需的。 a> J Neurosci 33（20）：8596-8607。