材料和试剂

新鲜的辣椒水果（解剖成果皮组织，在-80℃冷冻或冻干的果皮组织）
N <2>气体
CHCl 3（HPLC级）（Sigma-Aldrich，目录号：472476）
2-丙醇（HPLC级）（Sigma-Aldrich，目录号：34863）
甲醇（HPLC级）（Sigma-Aldrich，目录号：179337）
KOH（Sigma-Aldrich，目录号：P-1767）
甲基叔丁基醚（MTBE）（HPLC级）（Sigma-Aldrich，目录号：34875）
β-胡萝卜素（Sigma-Aldrich，目录号：C4582）
叶黄素（Sigma-Aldrich，目录号：07168）
番茄红素（Sigma-Aldrich，目录号：75051）
花青素（CaroteNature，目录号：0231）
辣椒红（CaroteNature，目录号：0335）
Capsorubin（CaroteNature，目录号：0413）
玉米黄质（CaroteNature，目录号：0119）
紫黄质（CaroteNature，目录号：0259）
β-隐黄素（CaroteNature，目录号：0055）
甲醇KOH（将固体KOH晶体加入到甲醇中，直到溶液饱和）

设备

Farberware软握把（Food Chopper，型号：83427-93）
Polytron发生器（Polytron Technologies，型号：PT 10-35）
温度块（具有1.8ml微量离心管架）（Thermolyne Dri-Bath，型号：DB-17615）
装备有光电二极管阵列检测器和YMC类胡萝卜素柱（4.6×250mm）（Waters）的HPLC系统
浴超声波仪（Branson超声波清洗机，型号：2510）
离心机（能够1,000×g，在4℃下5分钟）
微量离心机
UV/Vis分光光度计
涡流搅拌器
通风橱
氮气蒸发器（Organomation Associates，型号：N-EVAP-112）

程序

萃取
1. 如果使用干燥（冻干）果皮样品，使用〜0.25至0.5g 每次提取，用研钵和研杵将样品研磨成粉末。如果使用新鲜冷冻的果皮样品，每个使用约2.5至5g 萃取。使用手动食品剁碎机将冷冻的果皮切成测量〜4mm 2的小块。见图1.
  
  图1.处理新鲜的辣椒。 A.将果皮样品置于下室中的食物斩波器。 B.样品切成非常小的块C.
2. 将样品置于50ml塑料管中，加入〜25ml CHCl 3并使用 polytron彻底匀化样品，〜20〜30秒。参见图 2.
  
  图2.新鲜辣椒的均质化。 A。切碎的果皮在具有25ml CHCl 3的40或50ml管中。 B.样品是用polytron均质化20至30秒。 C.新鲜水果样品完全分散在CHCl 3中。
3. 允许均质组织置于CHCl 3中30分钟，偶尔混合涡流混合器或浴槽超声波仪
4. 如果使用冷冻新鲜样品，离心样品以从CHCl 3相分离CHCl 3 水相（上层）; 1,000×g/g，在4℃下5分钟。保持CHCl <3>相。如果使用干燥样品，则不执行此步骤。
5. 使用Whatman 1（或等效的）滤纸和真空过滤器过滤CHCl 3萃取物。
6. 转移滤液到〜40 ml玻璃琥珀色小瓶，蒸发溶剂，使用N 2气体流并温和加热（50℃）。氮蒸发器在此步骤中工作良好
7. 将干燥的样品重悬在1.1ml 2-丙醇中。浴超声处理建议帮助重悬材料。
8. 材料可以在-20或-80°C下储存数周
9. 我们尽可能保持提取的样品在明亮的光线之外。在样品在烟气中的氮气蒸发器上的时间期间罩，我们保持灯罩在敞篷; 我们将样品存储在琥珀色中小瓶，我们尽可能保持在黑暗中的小瓶。
皂化
1. 在标准微量离心管中，合并0.5毫升2-丙醇提取物用0.1ml甲醇KOH，在1.8ml微量离心管中
2. 用移液器充分混合，然后在50℃下孵育30分钟
3. 通过在冰浴中浸泡约2分钟冷却样品，然后加入0.5ml水
4. 加入0.4ml CHCl 3。大力涡旋
5. 以最高速度（10,000至12,000×g/min）离心1-2分钟微量离心机以分离相。较低的离心力将也分解CHCl 3和水相
6. 移除（丢弃）上层相; 恢复下相。
HPLC分析
1. HPLC的样品体积通常为10至30μl。使用的体积取决于类胡萝卜素制剂的浓度。确定对于类胡萝卜素样品的1：100稀释的OD 450nm。如果稀释样品的a <450>为0.5至1.0，然后注入10μl 浓缩样品到HPLC上。如果A 450是0.25到0.5，则注射20μl。如果A <450> 为0.1至0.25，则注射30μl。如果吸光度高于1.0，然后适当稀释样品。如果吸光度低于0.1，然后适当地浓缩样品（例如在N 2气体流下蒸发一些溶剂）。
2. 在具有光电二极管阵列的HPLC系统上进行色谱法检测器使用完全可见光谱（400 - 700 nm）监测。柱是YMC类胡萝卜素柱，250mm×4.6mm，S =5μm。
3. 流速，2ml/min，用线性梯度洗脱0至30分钟，如下：
  1. 溶剂A：甲醇:MTBE:水= 81:15:4（体积：体积：体积）
  2. 溶剂B：MTBE：甲醇：水= 88:8:4（体积：体积：体积）
    
    时间（分钟）
    A
    B
    
    0
    100％
    0％
    
    30
    33％
    67％
    
    31分钟后，我们开始清洗/翻新色谱柱：
    31       0％       100
    34       0％       100
    35       100％       0
    39       100％       0
校准曲线
1. 使用参考在450nm处产生校准曲线标准：β-胡萝卜素，叶黄素，番茄红素，辣椒红，辣椒红素，玉米黄质，花青素，紫黄质和β-隐黄质。
2. 在CHCl 3中制备1mg/ml的储备溶液（也可以使用己烷）。
3. 通过制备代表10ng至3μg范围的样品稀释储备溶液并通过HPLC独立分析如上所述。单峰的保留时间和面积记录并绘制曲线下的量类胡萝卜素注射。
4. 在我们的实验室中，大多数类胡萝卜素具有线性在450nm处的反应在10ng至3μg之间检测，具有R 2 2值为0.999。
5. 我们用于转换HPLC峰面积的公式将特定的类胡萝卜素浓度表示为ng/g组织是：
  花青素（ng/g组织）:(峰面积-1316.8）/5,816.9/ 注射体积（μl）x样品稀释x未稀释的样品体积（μl）/组织质量（克）
  β-胡萝卜素（ng/g组织）:(峰面积 - 55,271）/4,253.5/注射体积（μl）x样品稀释度x未稀释样品体积（μl）/组织质量（克）
  β-隐黄质（ng/g组织）：（41,437 +峰面积）/6,758.4/注射体积（μl）x样品稀释x 未稀释的样品体积（μl）/组织质量（克）
  辣椒红（ng/g 组织）：（28,266+峰面积）/4,489.5注射体积（μl）×样品稀释x未稀释的样品体积（μl）/组织质量（克）
  Capsorubin （ng/g组织）：（26,864 +峰面积）/5,541.4/注射体积（μl）x 样品稀释x未稀释的样品体积（μl）/组织质量（克）
  叶黄素（ng/g组织）:(峰面积-1,428.9）/6312 /注射体积（μl）×样品稀释x未稀释的样品体积（μl）/组织质量（克）
  番茄红素（ng/g组织）：（28,266+峰面积）/4,489.5/注射体积（μl）x 样品稀释x未稀释的样品体积（μl）/组织质量（克）
  紫草黄（ng/g组织）：（28,616 +峰面积）/7,453.4/注射体积（μl）x 样品稀释x未稀释的样品体积（μl）/组织质量（克）
  玉米黄质（ng/g组织）：（92,586 +峰面积）/7,220.6/注射体积（μl）x 样品稀释x未稀释的样品体积（μl）/组织质量（克）
  总类胡萝卜素（ng/g组织）：（整个色谱峰面积 - 55,271）/4,253.5/注射体积（μl）x样品稀释度x未稀释样品体积（μl）/组织质量（克）
6. 植物样品表征，一式三份独立提取每个基因型和每个类胡萝卜素的平均浓度使用具体的独立HPLC分析计算校准曲线以确定每个相应峰的丰度（例如图3中的峰1-7）。我们使用的校准曲线 β-胡萝卜素来估计未分配的类胡萝卜素峰的丰度，在参考标准的保留时间不洗脱的那些（例如图3中的峰a-g）。
  
  图3. 辣椒的果皮提取物的HPLC分离。皂化的类胡萝卜素提取物来自三个辣椒品种的成熟果皮，CosteñoAmarillo， Costeño红和NuMex石榴石。已知的峰是：1，紫黄质;如图2所示，叶黄素3，辣椒红; 4，玉米黄质; 5，β-隐黄质;如图6所示， α-胡萝卜素7，β-胡萝卜素。未鉴定的类胡萝卜素峰标有字母，a-g。光电二极管阵列的吸收光谱为未知峰提供在右边。 HPLC条件为描述。

代表数据

典型的色谱图的实例显示在图3中。顶部样品（绿色线）来自橙色的辣椒果皮果皮样品，而两个下部迹线（红色和蓝色线）代表红色的类胡萝卜素着色的辣椒水果样品。
当我们从相同的皂化的水果提取物重新运行样品时，本方案的实验室的变异系数为<5.0％。辣椒果实中类胡萝卜素丰度的生物变异性可以高得多，约20％变异。我们常规地对特定水果阶段和/或基因型的3至5个独立样本进行采样，以捕获这些样本中的生物变异性。

笔记

为了帮助减少样品中的生物变异性，我们优选使用干燥或冻干的植物组织。这减少了当您分配水果样品进行提取时发生的水重量的变异性。根据果实类型，样品重量可能有相当多的差异，取决于果实成熟阶段和外果皮的厚度。
定期运行校准标样是重要的，以确保色谱条件保持恒定。较便宜的类胡萝卜素标准品，β-胡萝卜素和叶黄素可用于监测色谱条件。这些校准运行的频率取决于研究项目的工作负荷，但是应该至少每两个月或在任何新的分析项目开始时检查峰值是否在适当的保留时间内洗脱。
我们没有测试大量的HPLC色谱柱用于分离类胡萝卜素，我们知道C30 YMC类胡萝卜素柱效果非常好，而C18色谱柱至少在我们的溶剂系统中不能分离出类胡萝卜素。

食谱

所有溶液如上所述使用标准方法制备。这些解决方案的准备没有异常的方面。所有溶剂均为HPLC级;水是去离子水。在HPLC上使用前，我们没有发现有必要对溶剂进行脱气或真空过滤溶剂A：甲醇:MTBE:水= 81:15:4（体积：体积：体积）溶剂B：MTBE：甲醇：水= 88:8:4（体积：体积：体积）

致谢

该协议改编自我们实验室以前的工作;参见Rodriguez-Uribe等人（2012）。这项工作部分由NM农业实验站，USDA CSREES批准2009-34604-19939和USDA NIFA 2010-34604-20886支持。

参考文献

Kilcrease，J.，Collins，A.M.，Richins，R.D.，Timlin，J.A.，O'Connell，M.A。（2013）。多种显微镜方法证明了在不同的辣椒中的色质体结构和类胡萝卜素组成之间的联系 fruit。 Plant J 76：1074-1083。
Rodriguez-Uribe，L.，Guzman，I.，Rajapakse，W.，Richins，R.D.and O'Connell，M.A。（2012）。橙色色素的辣椒果实中的类胡萝卜素积累，受多个水平调节。 J Exp Bot 63（1）：517-526。