材料和试剂

植物材料：1-3周龄体外生长的拟南芥无菌幼苗条件
20mM HEPES（pH7.2）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
MS培养基（Duchefa Biochemie，目录号：M0222）
次氯酸钠（NaOCl）（Sigma-Aldrich，目录号：425044）
DAF-2DA（Enzo Life Sciences，目录号：ALX-620-056-M001）
PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂）
DCF-2DA荧光染料（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：D-399）
羧基-PTIO钾盐（Sigma-Aldrich，目录号：C221）
硫酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：S9251）
（1-萘基）乙二胺（NED）（Sigma-Aldrich，目录号：222488）。
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（Difco）

设备

幻灯片
盖舌
徕卡荧光显微镜
灭菌镊子
无菌移液器吸头
微量离心管
微孔胶带（VWR International，目录号：115-8172）
培养皿

软件

Image J软件（版本1.45）Wayne Rasband（NIH）

程序

NO和ROS的本地化 DAF和DCF荧光
1. 表面消毒拟南芥的种子（L.）Heynh。（Col-0）在10％NaOCl和0.1％Tween-20洗涤剂中孵育种子10分钟，用高压蒸馏水洗涤三次
2. 转让灭菌种子在Murashige Skoog（MS培养基）上水平1.5％琼脂平板，用微孔胶带封闭平板并培养12小时天。
3. 生长木霉（< em> T。asperelloides）T203和尖孢镰孢（Fusarium oxysporum）（ F 尖孢镰孢）f。 sp。在PDA马铃薯葡萄糖琼脂（PDA; 39g/L）平板上在28℃下培养10天
4. 通过温和刮擦收获T203分生孢子在5毫升无菌水中的培养皿，由菌丝体和孢子，并将溶液（含有菌丝体+孢子）添加到2-ml 微量离心管中必须有植物完好的根系放置（如图1所示）。
5. 建议进行以下治疗：
  1. 未处理植物（对照）。
  2. 与 T孵育。对于各种时间间隔的非对映异构体，如Gupta等人（2014）。
  3. 根据实验孵育尖孢镰孢 - 10分钟至4小时。
  4. 与胚胎同时孵育。 asperelloides sand F。 oxysporum。
6. 一旦真菌孵育完成，从微量离心机中取出植物并用HEPES缓冲液洗涤三次
7. 在黑暗中用10μMDAF-2DA或DCF-2DA（2ml体积）孵育整个植物10分钟（图1）。
8. 用HEPES缓冲液洗涤过量的DAF或DCF-2DA染料三次
9. 在明视场模式下观察根，并捕获图片。
10. 观察荧光发射使用505至530nm 带有515 nm长发射滤光片的激发滤光片量化图像使用Image J软件通过选择感兴趣的区域并转到菜单下的图像J，然后单击以进行分析，然后单击子菜单测量。
通过气相试剂测定法测定NO
1. 将1g根材料放入含有4ml HEPES缓冲液的10ml小锥形瓶中（图1）。
2. 取一圈充满接种物，其中含有菌丝体和孢子，并加入到锥形瓶中
3. 建议进行以下治疗。
  1. 未处理植物（对照）。
  2. 用不同的间隔孵育T. asperelloides 。
  3. 孵育 F。 oxysporum - 对于各种时间间隔图1.
  4. 与胚胎同时孵育。非对映异构体和 F。 oxysporum 。
4. 在无空气的情况下在锥形瓶中冲洗溶液（这是一个安全的过程）（如图1B所示）
5. 将排放的含有NO的空气（鼓泡）捕获到2ml溶液中含有1ml 1％w/v磺胺和0.02％w/v N-（1） - （萘基）乙二胺二盐酸盐（Greiss试剂）（如图1B所示）
6. 在分光光度计中读取540 nm处的吸光度
7. 用0.1到5μM的亚硝酸盐制成标准曲线。
  
  Figure1。 A.通过DAF和DCF2DA荧光检测NO和ROS; 根在含有真菌+孢子的溶液中温育，然后转移到DAF或DCF溶液和监测的荧光B. 释放到气相中，通过Griess试剂检测。 1g根置于含有4ml HEPES（pH7.6）和的三角烧瓶中用无NO空气冲洗，然后从根产生的NO响应真菌感染被捕获在试剂中。

致谢

这项工作得到了马克斯·普朗克学会（KJ Gupta; Y。布罗特曼）和Marie Curie Intra欧洲团队在第七届欧洲共同体框架计划（KJ Gupta）和BBSRC-DEFRA-HGCA SCORE LINK赠款（LAJ Mur）。

参考文献

Gupta，K.J.，Mur，L.A。和Brotman，Y。（2014）。 Trichoderma asperelloides抑制尖孢镰刀菌引起的一氧化氮产生拟南芥根。 Mol Plant Microbe Interact 27（4）：307-314。
Gupta，K.J。和Igamberdiev，A.U。（2013）。建议使用至少两种不同的方法来衡量NO。 Fron Plant Sci 4。