材料和试剂

脾细胞来源：6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠（Jackson ImmunoResearch Laboratories）
鼠B16Flt3L黑素瘤细胞系[如Mach等人（2000）所述]
超纯水
0.05％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：25300-054）
异氟烷（Sigma-Aldrich，目录号：CDS019936-250MG）
胶原酶D（Roche Diagnostics，目录号：11088858001）
DNase I，干粉（QIAGEN，目录号：79254）
70％乙醇（由200标准乙醇制备）（Thermo Fisher Scientific，目录号：9-6705-004-220）
RBC裂解缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：R7757）
具有L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：11875-119）
具有L-谷氨酰胺的DMEM培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：11995-073）
200mM L-谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：25030081）
MEM非必需氨基酸（Life Technologies，Gibco ，目录号：11140-050）
MEM必需氨基酸（Life Technologies，目录号：11130-051）
β-巯基乙醇（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：21985-023）
丙酮酸钠（Life Technologies，目录号：11360-070）
HEPES（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15630）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Ca 2+和Mg 2+，游离，pH 7.2）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号： 20012-050）}
具有Ca 2+和Mg 2+的Dulbecco's PBS（DPBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14040-182）
0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（Life Technologies，目录号：15575-020）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
胎牛血清（Atlanta Biologicals，目录号：S11050）
青霉素/链霉素（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15140-163）
台盼蓝（干粉）（Sigma-Aldrich，目录号：T6146-5G）
与抗小鼠CD19缀合的磁珠（Miltenyi Biotech，目录号：120-000-323）
与抗小鼠CD11c（Miltenyi Biotech，目录号：130-152-001）缀合的磁珠
CD8α^Pos小鼠DC分离试剂盒（Miltenyi Biotech，目录号：130-091-169）
Fc-γ受体阻断抗体（克隆2.4G2）（BD Biosciences，目录号：553141）。
抗小鼠CD11c-FITC（BD Biosciences，目录号：553801）
抗小鼠CD8α-PerCP（BD Biosciences，目录号：553036）
抗小鼠B220-PE（BD Biosciences，目录号：553090）
0.08％台盼蓝（见配方）
无血清DMEM和RPMI培养基（参见配方）
完成RPMI和DMEM介质（请参阅配方）
MACS缓冲区（参见配方）
FACS染色缓冲液（参见配方）
10x胶原酶D溶液（见配方）

设备

1ml注射器（BD，目录号：26048）
23 G1针（BD，目录号：305145）
100mm培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：0875712）
外科器械（Kent Scientific，目录号：INSMOUSEKIT）
细胞过滤器（70μm）（BD，目录号：352350）
大培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：FB0875712）
真空过滤系统（500ml，0.22μm）（Corning，目录号：431097）
LS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
磁性台MACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-302）
大孔200μl移液管吸头（PerkinElmer，目录号：111623）
Corning超低附着96孔板（Corning，目录号：CLS3474-24EA）

程序

图1。细胞富集方案方案

B16.Flt3L黑素瘤在小鼠中的植入
1. 使B16.Flt3L黑素瘤细胞系在完全DMEM中生长至汇合培养基的标准细胞培养瓶（25cm 2）中，并且细胞是通过胰蛋白酶消化收获。为此，从中抽吸培养基培养，并用无菌PBS洗涤贴壁细胞。洗涤后，加入5ml胰蛋白酶EDTA（0.05％）溶液并在37℃下孵育5分钟。
2. 孵育后，轻轻敲打一边的烧瓶，以将细胞从容器的表面提起。
3. 加入20ml完全DMEM培养基以淬灭蛋白酶消化
4. 从烧瓶中收集细胞，轻轻地吸取上下三个次，然后将培养基收集到无菌的50ml离心机中管。
5. 通过在4℃下以300×g离心5分钟沉淀沉淀细胞 C。用PBS洗涤细胞三次，并重悬在PBS中密度为10 8个细胞/ml。
6. 注射100微升细胞的小鼠悬浮液（10μL细胞）皮下注射到区域中的单个位点肩膀在颈部的底部。这个和所有其他程序涉及动物必须按照并经批准机构动物使用和护理委员会（IACUC）。
7. 允许肿瘤生长直到可触及或可见（直径2-10mm，通常 7-10天），然后处死动物收获器官
脾单细胞悬液的制备
1. 用异氟烷麻醉小鼠。麻醉的典型方法包括将动物放置在连接到的诱导室中氧源和异氟烷蒸发器，并调节氧气流量 0.9升/分钟，异氟烷蒸发器为3.5％。一旦小鼠变得无反应，它们被颈椎脱臼所牺牲
2. 用70％乙醇喷洒皮肤，消毒腹部左侧。
3. 在清洁，无菌条件下工作，在下切口肋骨左侧的腹部和提取脾使用剪刀。置于无菌无血清RPMI培养基中
4. 从这一步开始，在生物安全柜中工作，并在无菌条件下执行所有步骤。
5. 通过将无菌提取的脾浸没在5毫升中洗涤无血清RPMI培养基，然后转移至新鲜的100mm直径培养皿。注意，因为脾细胞的高产率 B6.Flt3L肿瘤携带小鼠，一只脾对大多数是足够的实验，这个协议是用于处理单个脾脏。对于涉及两个或更多个脾的汇集的较大实验，卷可能需要按比例增大。
6. 切脾使用剪刀将组织切成大约2mm的小块并在10℃下孵育 ml胶原酶D（〜200单位）和DNA酶I（10μg/ml）溶液 ℃30分钟。确保组织片完全浸没解决方案。
7. 放置在新鲜的70微米细胞过滤器培养皿，并通过用25分钟移液将组织片转移到它 ml移液管。
8. 通过轻轻压缩脾碎片组织碎片靠着注射器柱塞的网。洗涤滤网用5ml完全RPMI培养基通过洗涤细胞过滤器和进入收集盘。使用70μm网过滤器更大的细胞聚集体，并有助于产生单细胞暂停。
9. 通过在300×g离心5分钟使沉淀细胞沉淀
10. 弃去上清液，向沉淀中加入2ml RBC裂解缓冲液
11. 通过用1ml移液管吸取三次轻轻混合，并进一步在室温下孵育5分钟。避免更长时间的孵化 RBC裂解缓冲液，因为这可能损害细胞活力
12. 通过加入完全RPMI培养基（12ml）中和RBC裂解缓冲液每脾）至所得悬浮液并在300×g离心5分钟 min。
13. 重悬细胞沉淀在MACS缓冲液，使用0.5毫升每脾。通过70μm细胞过滤器过滤以除去细胞团防止MACS列阻塞。
纯化来自脾单细胞悬浮液的CD8α肿瘤细胞和CD8α肿瘤细胞来自脾细胞悬浮液的CD8α支原体DCs和CD8α支原体DC的分离是如图1所示的三步骤方案。其依赖于不想要的群体如B， T和NK细胞，然后在第二步中阳性选择CD8α阳性DC，在第三步阳性选择CD8α阴性树突状细胞。保持细胞在冰上，并使用预冷缓冲液，以保持2-8°C的工作温度，以防止抗体封顶和非特异性绑定到不相关的细胞。
1. 确定细胞数量，并将浓度调节至约5 x 10包含20μg/ml Fc-γ受体的MACS缓冲液中的10 8细胞/ml 阻断抗体（2.4G2）
2. 对于每10个总细胞，加入100μl 的CD8α^Pos DC分离试剂盒中提供的生物素抗体混合物。抗体混合物结合B细胞，T细胞和NK细胞
3. 充分混合并在冰冷的水（4-8℃）中孵育15分钟。
4. 对于每个10 8个总细胞，加入150μl的MACS缓冲液和100μl 抗生物素珠提供在CD8αpos DC分离试剂盒中。
5. 轻轻混合并再次在冰冷的水（4-8℃）中孵育15分钟。
6. 通过在300×g离心5分钟加入12ml MACS缓冲液和沉淀细胞。
7. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬在2ml MACS缓冲液中
8. 将新鲜的MACS柱置于适当的MACS分离器的磁场中。
9. 通过用5ml MACS缓冲液洗涤平衡柱。
10. 在柱中间轻轻吸取细胞悬液。
11. 收集未标记的流过柱子的细胞用10ml MACS缓冲液洗涤。因此，未标记的流量收集富集DC。
12. 通过在300×g离心5分钟来沉淀富集的DC部分。
13. 将细胞重悬在1ml MACS缓冲液中，加入200μl抗CD8α 共轭的Miltenyi磁珠悬浮液并在冰冷下孵育水（4-8℃）再搅拌15分钟
14. 重复步骤C6-11。 CD8α支持树突状细胞与抗CD8α磁珠结合在此富集方法中，因此保留在列中。的柱的流过物富集了CD8α^{Neg DCs并耗尽 CD8αpos}树突状细胞。流通应保留用于在下面的步骤C18-22中分离CD8α^Neg树突细胞。
15. 要从柱中洗脱CD8α^Pos DC，请轻轻地从柱中取出柱磁场，加入5毫升MACS缓冲液，并牢固地吹扫色谱柱用注射器柱塞
16. 为了提高纯度，将富集CD8α的Pos细胞通过两个连续的柱。为了这，在步骤C15中沉淀洗脱的细胞，用2ml MACS缓冲液重悬重复步骤8-15。
17. 将收集的CD8α^Pos DCs沉淀离心，重悬于0.2ml培养基中并计数。保持细胞冰直到需要增强活力。
18. 用于隔离 CD8α^Neg DC，使用未标记的细胞作为柱流收集通过。通过离心沉淀细胞并重悬 300μlMACS缓冲液。
19. 加入100μl的抗CD11c磁珠，并在冰冷的水（4-8℃）中孵育15分钟。
20. 重复步骤C6-10。
21. 用10 ml MACS缓冲液洗柱。洗脱含有富集的CD8α^{Neg DC的柱滞留物}
22. 沉淀细胞并重悬于2ml MACS缓冲液中并通过它们通过第二MACS柱以提高纯度（如果需要）。
从脾细胞悬液中分离B细胞
1. 确定单元格号。
2. 加入200μlMACS缓冲液 20μg/ml Fc-γ受体阻断抗体（2.4G2）和150μl 抗CD19共轭磁珠
3. 充分混合并在冰冷的水（4-8℃）中孵育10分钟。
4. 通过在300×g离心5分钟加入12ml MACS缓冲液和沉淀细胞。
5. 弃去上清液并重悬细胞沉淀2ml MACS缓冲液
6. 将MACS列放置在适当的MACS分隔符的磁场中。
7. 通过用5ml MACS缓冲液洗涤平衡柱。
8. 在柱中间轻轻吸取细胞悬液。
9. 这是一个积极的选择，所以目标单元格将被保留 MACS列。要从柱中洗脱细胞，轻轻取出柱从磁场中，加入5 ml MACS缓冲液，并吹扫色谱柱牢固地用柱塞收集CD8αPosDC。
脉冲APCs与抗原和细胞转移
1. 通过台盼蓝排除法计算MACS富集程序后的活细胞。
2. 平板细胞在低结合的U-底96孔板中，以每孔10 6个细胞的密度在250μl含有目的抗原的完全RPMI中。用抗原脉冲细胞（通常在浓度为100nM，尽管这可能根据不同而不同特定抗原）在37℃培养箱中保持5％CO 2下培养1小时。使用低结合板允许更容易回收粘附细胞人口
3. 通过吸移上下5次收获细胞与大口径的提示。池细胞从多个井和转移到 15 ml管。添加完全RPMI培养基到10毫升和沉淀的细胞在300×g离心5分钟。用PBS洗涤两次。
4. 计数再次将细胞重悬于PBS中至10 7个细胞/ml的细胞密度。使用这些细胞注射到小鼠的首选途径行政。

代表数据

图2.脾脏亚群的前和后富集分析 B和树突细胞被鉴定为存在于细胞中的B220阳性（R1，38.5％）和CD11c阳性（R2，25.5％）活细胞肿瘤移植后第8天的B16.Flt3黑色素瘤携带小鼠的脾脏。在第二张图中，可以在CD11c阳性细胞（R3门）上观察到CD8α表达的梯度。在后富集图中，确定了B细胞，CD8αpos pos和CD8α阳性DC的相对纯度。富集的CD8α阴性DC亚群中CD11c的染色与用于分离这些细胞的抗CD11c珠竞争，从而导致观察到的CD11c-荧光染色的梯度。在所有情况下，发现细胞的纯度大于95％。

食谱

0.08％台盼蓝
将0.08克台盼蓝溶解在100毫升超纯水中
通过70μm过滤器过滤以除去未溶解的聚集体
无血清DMEM和RPMI培养基
根据您的需要，将所有以下成分混合在生物安全罩中用于DMEM或RPMI培养基通过0.22μm真空过滤系统对介质进行灭菌 500ml含L-谷氨酰胺的DMEM或500ml含L-谷氨酰胺的RPMI-1640 5ml MEM非必需氨基酸（100x，10mM） 5ml HEPES缓冲液（1M） 5ml L-谷氨酰胺（200mM） 0.5ml 2-巯基乙醇（5.5×10 -2 M）
完成RPMI和DMEM媒体
加入50毫升热灭活的胎牛血清到无血清RPMI或DMEM培养基中，得到完全培养基
MACS缓冲区
将2ml的0.5M EDTA和10ml热灭活的胎牛血清加入到500ml磷酸盐缓冲盐水（PBS，Ca 2+和Mg 2+）中， pH 7.2）
过滤灭菌，并在使用前通过使用真空至少15分钟使缓冲液脱气，以避免气泡堵塞柱子
FACS染色缓冲液
将叠氮化钠溶于MACS缓冲液中的0.05％（0.25g/500ml），得到FACS染色缓冲液
10x胶原酶D和DNase 1储备液
在含有Ca 2+和Mg 2+的20ml PBS中溶解1g胶原酶D和0.2ml DNA酶1储液（1mg/ml，100x），得到每毫升大约1,000-2,000单位胶原酶活性的溶液
该10x储备溶液可以等分为1ml小瓶并在-20℃下储存数周。在使用前立即用9ml无血清RPMI稀释1ml。

致谢

这项工作是由NIH/NIAID授予AI45889支持S.A.P.使用由爱因斯坦癌症中心（NIH/NCI CA013330）和AIDS研究中心（NIH/NIAID AI51519）支持的FACS核心设施进行流式细胞术研究。

参考文献

Arora，P.，Baena，A.，Yu，KO，Saini，NK，Kharkwal，SS，Goldberg，MF，Kunnath-Velayudhan，S.，Carreno，LJ，Venkataswamy，MM，Kim，J.，Lazar-Molnar， E.，Lauvau，G.，Chang，YT，Liu，Z.，Bittman，R.，Al-Shamkhani，A.，Cox，LR，Jervis，PJ，Veerapen，N.，Besra，GSand Porcelli， 2014）。树突状细胞的单个子集控制天然杀伤T细胞对多种糖脂抗原的反应的细胞因子偏好。免疫力 40（1）：105-116。
Mach，N.，Gillessen，S.，Wilson，S.B.，Sheehan，C.，Mihm，M。和Dranoff，G。（2000）。体内刺激的树突状细胞中的差异通过工程化分泌粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子或Flt3-配体。 Cancer Res 60（12）：3239-3246。