材料和试剂

pBAD/myc -His表达载体（Life Technologies，目录号：V440-01）
L - （+） - 阿拉伯糖（Sigma-Aldrich，目录号：A3256）
羧苄青霉素（Carbenicillin Direct）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
胰蛋白胨（Fluka，目录号：T7293）
酵母提取物（Fluka，目录号：92114）
氯化钾（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP366）
大肠杆菌（大肠杆菌）TO114（日本千叶大学Kobayashi教授的礼物）
吖啶橙半（氯化锌）盐（Sigma-Aldrich，目录号：A6014）
BisTris丙烷（BTP）（Sigma-Aldrich，目录号：B6755）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（DNase）（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
羰基氰化物3-氯苯基腙（CCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2759）
DL-乳酸钠溶液50％水溶液（VWR International，目录号：27927.298）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O 7H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，目录号：M/1000/60）
胆酸钠水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C1254）
无水乙醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：E/0650DF/17）
高纯度（18MΩ）Millipore或AnalR水
氯化胆碱（Sigma-Aldrich，目录号：C1879）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
DL二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
TRIZMA碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
32％盐酸（VWR International，目录号：20254.321）
LBK琼脂（见配方）
LBK液体介质（见配方）
Tris /胆碱/二硫苏糖醇/蔗糖（TCDS）缓冲液（参见Recipes）
运输测定缓冲液（参见配方）
200 mM DL-乳酸钠溶液（见配方）

设备

温控的细菌生长摇动培养箱
用于细菌菌落生长的培养皿
100ml锥形瓶
250ml锥形瓶（×2）
5,000ml锥形瓶（×2）
大冰桶
冷冻，大容量离心机和转子收获细菌细胞
1,000 ml或500 ml离心机罐和盖
台式涡流器
100毫升烧杯和搅拌棒以适应
磁力搅拌器
25 ml一次性塑料移液器
选择单通道移液器（1,000μl，100μl，20μl，10μl）
以上的移液器提示
冷冻离心机和转子，能够以18k/g 旋转约50ml管子
冷冻超速离心机，转子和聚碳酸酯超速离心管，能够处理〜30 - 50 ml的体积
French Press（Thermo Fisher Scientific，目录号：FA-078）
标准压力室（40kpsi; 35ml容量）（Thermo Fisher Scientific，目录号：FA-031）
50 ml注射器（用于过滤溶液）
0.22μm无菌过滤器，适合50 ml注射器
1升和500毫升杜兰瓶盖子
1.5 ml Eppendorf管
医用湿巾（Kimwipes ^®）
parafilm
UV/vis分光光度计和10mm长度石英比色皿
10×4mm，用于荧光光谱的1400μl体积石英比色杯（Hellma，目录号：104F-QG）
小型磁力搅拌棒，以适应石英比色杯
荧光计。 Fluoromax-4（Horiba），可进行基于时间的采集测量，并配有温度受控的试管架和搅拌器
用于干燥比色皿的压缩空气源（气溶胶罐或固定供应源）

程序

细菌培养物的生长和收获和倒置膜囊泡的制备
1. 用pBAD/emc -His A质粒DNA进行新的转化编码野生型或突变型转运蛋白（或您的选择的载体编码您感兴趣的转运蛋白）转化为化学感受态。大肠杆菌 TO114细胞。将细胞铺在Luria Bertani钾（LBK）琼脂上含有100μg/ml羧苄青霉素用于选择。必须使用LBK琼脂而不是常规的Luria Bertani（LB）琼脂，因为后者包含 NaCl和TO114菌株由于缺失对该盐敏感染色体编码的Na +/+/H + +反向转运体NhaA。孵育平板在37℃过夜（〜15至约18小时）
2. 从中选择几个单一的殖民地琼脂板上并用于接种2×250ml锥形瓶含有100ml补充有100μg/ml的LBK液体培养基羧苄青霉素。在30℃下以250rpm生长培养物过夜（〜15h）在温度控制的摇动培养箱中振荡。测量使用a。在600nm处的光密度（OD <600）分光光度计;它应该在3.0-3.3之间。如果OD <600> 较小比3.0，然后再孵育0.5-1.0小时并重新测量。如果 OD 600大于3.3，培养物长满和新鲜文化将需要准备
3. 接种2 x 5 L锥形烧瓶中，每个含有1,000ml补充有LBK液体培养基 100μg/ml羧苄青霉素，15ml过夜培养物。在32℃孵育 ℃，在温度控制的摇动中以270rpm摇动约2.5小时孵化器。 OD <600> 应为〜0.6。将温度降至25°C和以270rpm摇动生长直至OD 600为1.0。这通常需要在0.5至1.0小时之间
4. 通过加入诱导MdtM的过表达 0.1％w/v L - （+） - 阿拉伯糖[5ml 20％w/v L - （+） - 阿拉伯糖] 烧瓶。加入阿拉伯糖后，将细胞再培养1.5小时在25℃，270rpm摇动，然后收获
5. 传输 E。大肠杆菌 TO114细胞，其含有过表达的转运蛋白到500ml或 1,000毫升容量离心机罐已经预先在冰上冷冻至少15分钟。预冷离心机至4°C并收获细胞在5,000xg离心20分钟。
6. 滗析上清液并通过在冷冻（4℃）TCDS中重悬来洗涤沉淀的细胞缓冲。使用30毫升TCDS缓冲液每升一升的细胞培养物沉淀。在此过程中保持细胞在冰上。收成通过如步骤A1（上述）中所述的离心来洗涤细胞重复洗涤程序。在30中重悬所得细胞沉淀 ml含有2mM PMSF的冷冻TCDS缓冲液（其应该补充作为100mM储备在乙醇中并储存在-20℃;确保解决方案在使用前彻底解冻并剧烈涡旋）和5μMDNA酶并将混合物保持在冰上
  1. 通常，1L细菌细胞培养物将为这些实验提供足够的材料。
  2. 细胞应通过使用台式轻轻涡旋重悬涡旋器或通过使用25ml无菌塑料移液管温和抽吸。
7. 将重悬的细胞倒入含有搅拌器的100ml烧杯中棒，置于磁力搅拌器上并在4℃的冷室中搅拌20分钟 min。或者，将烧杯置于冰上的冰桶中，放置磁搅拌器并搅拌20分钟
8. 方法为反向囊泡的产生依赖于流体的组合剪切力和当细胞混合物通过时产生的减压通过法国压力单元的针阀。生成反转通过重悬的细胞混合物的单次通过来分离膜囊泡通过法式压力室至少4,000psi。如果压力太低，不会形成反相囊泡。压力细胞应在冰上冷冻〜30分钟后使用。所结果的倒置的囊泡混合物应收集在100ml锥形瓶中保持在冰上
9. 将混合物倒入预冷的〜50ml 离心管并除去任何未破损的细胞和细胞碎片在4℃下以18,000×g离心10分钟。小心倾倒上清液（不要打扰含有未破坏细胞的沉淀物细胞碎片）包含在预冷冻的细胞膜囊泡中在冰上用30-50ml体积的聚碳酸酯超速离心管
10. 通过超速离心以100,000 x g 收获倒置的囊泡1分钟 h。小心倾析上清液并保留沉淀。将含有沉淀囊泡的超离心管置于冰上
11. 重悬在1ml冰冷的TCDS缓冲液中倒置的囊泡沉淀通过使用1000μl移液管温和吸出。转移重悬小泡置于预冷的1.5ml Eppendorf管中，用于冰上运输测定。根据我们的经验，存储在冰上的泡囊是稳定的几个小时。
12. 量化总膜蛋白含量通过在280nm处的UV吸收光谱测定倒置的囊泡。空白分光光度计使用10 mm光程石英比色杯 1,000μlTCDS缓冲液。缓冲液应在室温至室温防止反应杯面的结霜。清洁试管的表面在测量前使用新鲜的纸巾。一旦分光光度计为空白，从比色杯中取出5μl缓冲液使用10μl移液管并用5μl的囊泡替换。封面打开具有Parafilm正方形的比色皿并倒置比色皿a 几次以确保囊泡的均匀分布。记录在280nm处的囊泡混合物的吸光度并计算总量膜蛋白浓度，假设A 280为1.0 相当于蛋白质浓度为1.0mg/ml 注意：
  1. 记住乘以一个因子获得的280 nm吸光度值为200，计算未稀释的囊泡混合物的浓度以mg/ml为单位。
  2. 在这个准备阶段，重新悬浮囊泡可以以25-100μl的等分试样转移到管中，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下用于随后的使用。以这种方式冻结的囊泡将保持其完整性几个个月。然而，如果冷冻的囊泡原液用于随后的运输测量，囊泡必须在冰上非常缓慢地解冻在使用前防止其骨折。
荧光法测定
1. 在本节中，我们描述了Fluoromax-4的设置参数荧光计。然而，这些参数可以形成基础设置其他荧光计。一旦仪器开启，软件启动，将试管架的温度设置为25°C。打开仪器软件并选择基于时间的数据采集激发和发射波长为492nm和525nm，分别。设置激发和发射缝隙宽度为1.5 nm和 2.5nm。
2. 添加一等分的倒囊泡（应在TCDS缓冲液中的冰上保持）至室温运输测定缓冲液中含有吖啶橙探针在10mm x 4mm石英比色皿中至终浓度为0.5mg/ml膜蛋白质总体积为1500μl。最长路径长度比色杯应面向激发光源。放一个小磁跳蚤进入比色杯，轻轻搅拌内容物。允许囊泡和测定缓冲液平衡〜200秒
3. 开始录制荧光发射。大约50秒后，加入15μl的200 mM 储备钠DL-乳酸盐溶液到比色皿内容物以给出最终 DL-乳酸钠浓度为〜2.0mM。加入乳酸盐激发囊泡并产生呼吸依赖性ΔpH（酸内）穿过倒置的囊泡膜，当H sup + i被泵入囊泡内部。这导致吖啶橙的脱猝灭荧光信号（见代表数据中的图1）
4. 在建立ΔpH后，监测吖啶橙荧光淬灭进一步〜200秒，直到它稳定。启动MdtM介导，质子驱动反运输通过加入底物这种情况下胆汁钠胆酸钠）转化成倒置泡囊混合物。我们加入12.5μl的250mM储备溶液在高纯度水中以在〜2.0的比色杯中得到胆酸钠的最终浓度 mM。对于其他底物，我们建议测试范围从1 mM到 100mM以建立给出最佳脱猝灭的浓度信号。加入底物后，应该有即时的猝灭（上升）的吖啶橙荧光发射信号（见图1a）由于所建立的ΔpH的耗散作为结果 MdtM介导的胆酸钠/H + +抗末端活性和伴随的囊泡腔的碱化
5. 记录荧光脱猝信号50秒，使反向反应达到a 稳定状态（如通过荧光信号的平台所观察到的）。加入质子载体CCCP至〜100μM的终浓度（1.6μl的在乙醇中制备的100mM储备液）应该执行以消除ΔpH驱动的，MdtM介导的反运输活动。加入CCCP将导致进一步的脱落随着ΔpH消失，荧光信号（参见图1）。记录荧光信号进一步〜50秒，然后终止采集并保存电子数据
6. 将比色杯内容物倒入a 合适的废液容器，并用乙醇彻底清洗试管然后高纯度水。用压缩空气小心地干燥小杯。

代表数据

图1.当将胆汁盐加入到E的倒囊泡时，吖啶橙的荧光淬灭/去淬灭的代表性测量。过量产生重组（a）野生型MdtM或作为对照，（b）功能障碍的MdtM D22A突变体的大肠杆菌TO114细胞。通过加入DL-乳酸钠。如图所示，将胆酸钠加入到囊泡中以引发转运反应，并且将CCCP用于消散ΔpH。在添加胆酸钠时在对照实验（图b）中观察到的荧光猝灭是由于染色体编码的MdtM的反向端活性。以每秒计数（cps）测量荧光强度。请注意，您测量的荧光强度可能因仪器设置方式而异。上述迹线代表在至少两种单独的反转囊泡制备物上一式三份进行的实验的代表。

笔记

为了确保重现性，测定应至少进行两次单独的倒置泡囊制备，一式三份。
如果荧光信号不淬灭或增强，则囊泡不能保持完整性或不被倒转，并且其制备需要重复。
与依赖于荧光检测的所有测定一样，必须进行强有力的对照以确保任何检测到的转运活性可以明确地归因于感兴趣的蛋白质。在我们的实验中，我们使用过表达MdtM D22A（MdtM的功能失调点突变体）的反向囊泡作为阴性对照（参见图1b）。
如果该方法用于检测金属离子/H sup/+反向运动活性，则使用从大肠杆菌的反转录物缺陷型TO114菌株产生的反转泡囊是重要的，因为存在于细菌中的至少四种其它转运蛋白（NhaA，NhaB，ChaA和MdfA）催化单价金属阳离子/H ⁺交换。
最后，如果该方案用于比较野生型和突变转运蛋白的反向运动活性，则必须定量（通常通过免疫检测方法）反向囊泡膜中存在的靶蛋白的量，以确保H ⁺吸收仅由于转运蛋白活性的差异，而不是表达水平的差异。

食谱

LBK琼脂（100ml） 1.0克胰蛋白酶
0.5g酵母提取物
0.745克KCl
1.5克琼脂用高纯水补充至100ml，然后高压灭菌
当溶液仍然是液体并温暖触摸时，加入100μg/ml羧苄青霉素进行选择加入到无菌条件下的培养皿中
LBK液体培养基（1 L） 10g胰蛋白胨
5g酵母提取物
7.45克KCl
用高纯水补充至1000ml，然后高压灭菌
Tris /胆碱/二硫苏糖醇/蔗糖（TCDS）缓冲液（1L）由10mM Tris-HCl（pH7.5），140mM氯化胆碱，0.5mM二硫苏糖醇和250mM蔗糖组成。
1M Tris-HCl（pH7.5）10ml
2 M氯化胆碱70 ml
1M蔗糖250ml
用高纯度水补充至999.5毫升，然后检查pH值，如有必要用盐酸调整
高压灭菌或无菌过滤并在4°C下保存
在使用前立即从冷冻的1M储备液中加入0.5ml二硫苏糖醇
运输测定缓冲液（100 ml）
包括10mM BisTris丙烷（pH 7.2），5mM MgSO 4，1μM吖啶橙
100mM BisTris丙烷（pH7.2）10ml 2M MgSO 4 0.25ml
10mM吖啶橙10μl
用高纯水然后用无菌过滤器补充至100ml 吖啶橙是光敏感的，所以运输测定缓冲液和吖啶橙色股票应该存储在琥珀色瓶子或在避光在4℃在黑暗的容器
200mM DL-乳酸钠溶液（10ml） 0.45ml 50％DL-乳酸钠水溶液
用高纯水
补充至10ml 无菌过滤并在4℃下保存

致谢

这项工作由BBSRC拨款BB/K014226/1（向CJL）支持。以上描述的方案改变自之前报道的方案（Resch等人，2010）。

参考文献

Paul，S.，Alegre，K.O.，Holdsworth，S.R.，Rice，M.，Brown，J.A.，McVeigh，P.，Kelly，S.M.and Law，C.J。（2014）。主要促进者超家族的单组分多药转运蛋白是网络的一部分，可保护 Escherichia coli from bile salt stress。 Mol Microbiol 92（4）：872-884。
Reddy，V.S.，Shlykov，M.A.，Castillo，R.，Sun，E.I。和Saier，M.H.，Jr。（2012）。主要促进者超家族（MFS）重新审核 FEBS J 279（11）：2022-2035。
Resch，C.T.，Winogrodzki，J.L.，Patterson，C.T.，Lind，E.J.，Quinn，M.J.，Dibrov，P.and Hase，C.C。（2010）。推定的Na ⁺/H ⁺ 霍乱弧菌的转运体，Vc-NhaP2，在体内介导特异性K ⁺/H ⁺交换/a> Biochemistry 49（11）：2520-2528。