材料和试剂

小鼠（例如 Balb/c）8-20周龄
无Ca/Mg的无菌PBS（Euroclone，目录号：ECB4004L）
Pen/Strep：100x青霉素/链霉素/真菌的溶液（Life Technologies，Gibco ，目录号：15240-062）
庆大霉素（50mg/ml溶液）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15750-037）
RPMI 1640（含谷氨酰胺）（Lonza，目录号：BE12-702F）
胎牛血清（FBS）（热灭活的）（Lonza，目录号：DE14-801F）
0.4％台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
Phorbol 12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P8139-按照制造商的说明制备储备溶液）
离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I9657-按照制造商的说明书制备储备溶液）
常见的消毒剂（ 70-90％乙醇，碘酊）
PBS + 2％Pen/Strep（参见配方）
RPMI + 2％Pen/Strep（参见配方）
完整介质（见配方）

设备

软木片和钉
铝箔（或另一个光滑，非吸收性表面）
三只无菌小手术剪刀
注意：特别是一个用于切割皮肤，第二个用于切割肌肉的壁和肠，最后一个用于去除PP。
四个无菌小薄手术镊子，两个直和两个弯曲（直线切割皮肤，肌肉的墙和肠道;弯曲的排出粪便和移除PPs）
70μm细胞滤器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352350）
2.5 ml注射器
15和50ml离心管
24孔细胞培养板
冷冻离心机
无菌流量罩
恒温水浴
细胞培养的倒置显微镜
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养

程序

图1.从小肠分离PP细胞的图。从Lefrancois和Lycke（2001）修改。

去除小肠和切除淋巴集结
1. 安乐死小鼠通过CO 2窒息，遵循的指导线您的机构动物护理和使用委员会。立即进行可能无菌性肠道外植和PP解离获得最大细胞活力注意：所有后续步骤都应在无菌流罩中进行。
2. 轻轻地将鼠标放在它的背部，在柔软的木材表面，伸展四肢，用针固定四个爪子。
3. 用消毒剂清洁腹部。
4. 一把剪刀和一个直镊子用于执行中线切口和收缩皮肤，然后打开肌肉的墙另一个剪切沿中轴与一副新的剪刀和镊子
5. 切小肠约0.5厘米以下胃，拉出腹膜腔展开它。切肠约在盲肠上方1厘米，然后除去脂肪，肠系膜淋巴结和相邻组织注意：您可以使用与肌肉墙相同的剪刀和镊子切割肠。
6. 将肠子放在铝箔上，连续用冷PBS + 2％Pen/Strep润湿，以防止干燥。
7. 通过将弯曲的镊子平放在表面上排出粪便肠道并沿整个长度压下。轻按以避免打破肠。
8. 通过用a拧紧补丁来移除PP 新的弯曲的镊子和用剪刀切开，避免多少可能的周围肠壁。补丁显示为小突出白色/灰色结节（直径1-2毫米），类似于淋巴结，嵌入在外肠壁，这似乎是黄棕色。通常，可以从单个获得5至10个PP 小鼠，取决于年龄和应变注意：
  1. 存在过量的周围上皮降低了产量回收的细胞，因为它可以防止良好的机械解离。
  2. 如果酶的，去除周围组织是至关重要的进行解离; 在这最后一种情况下上皮内细胞可能污染所得的PP-单细胞。
9. 切除后，立即保存所有PP在1毫升冷RPMI + 2％钢笔/Strep。
通过机械解离分离PP细胞
1. 将所有PP转移到放置在50ml管上的70μm细胞过滤器中
2. 使用2.5毫升注射器柱塞轻轻粉碎解离PPs 补丁强制通过过滤器。解离期间洗涤用5ml冷RPMI + 2％Pen/Strep过滤（培养基流过过滤器包含PP的单个单元格）。
3. 重复步骤2两次更多，直到它们不再是可见的组织片。在此刻，管含有PP-单细胞流过过滤器并悬浮在15ml RPMI + 2％Pen/Strep中。
4. 400℃离心4分钟，4℃ 10分钟。弃去上清液，重悬细胞并加入10 ml 冷RPMI + 2％Pen/Strep
5. 重复步骤4两次。最后一次离心后，将细胞重悬在1-2ml冷RPMI + 2％Pen/Strep中
6. 使用台盼蓝染料排除计数活细胞注意：
  1. 从单个小鼠中回收的细胞数目的变异性是非常高，主要是由于老鼠（应变和年龄），经过的时间 PP的安乐死和解离之间的准确性删除每个PP。
  2. 机械解离允许主要分离非贴壁细胞，如B和T淋巴细胞。附着细胞包括单核细胞，树突和非免疫上皮细胞似乎以少量存在，因为它们需要酶促的治疗孤立。回收PP细胞的表型可以是通过FACS分析检查。
  3. 如果需要，可以进一步使用PP细胞通过用磁珠或FACS分选进行纯化[参见Guo et al。（2008）和Thornton（2003）在参考部分]。
体外 PP细胞的活化
1. 在4℃下，将合适量的细胞以400×g离心10分钟。
2. 在完全培养基中以2×10 6个细胞/ml的浓度重悬沉淀物，并在24孔板中培养PP细胞，1ml /孔，存在10ng/ml PMA和500ng/ml伊奥霉素至少24小时 37℃和5％CO 2培养箱注意：其他激活协议，对B或T淋巴细胞具有特异性[参见Li et al。（2006）和 Muul et al。（2011）in the references section]。
  可选：
  1. 到消除贴壁细胞，PP细胞可以在Complete中培养2-4小时中等（见配方）与PMA和没有抗生素的离子霉素。的粘附细胞（单核细胞和/或树突细胞）的存在差异调节B和T淋巴细胞的激活随后改变免疫应答。
  2. 尽量避免尽可能细菌污染，洗涤和培养PP细胞如上所述24小时，在完全培养基+ PMA /离子霉素中，用100 μg/ml庆大霉素代替青霉素/链霉素。使用a 不同的抗生素确保消除各种细菌。
3. 24小时（或更多）后，可以收集培养物的上清液，在4℃下离心4分钟，10分钟以除去细胞用于测试特异性抗体或细胞因子的存在。活性可以收获细胞，通过在4℃下离心10分钟来洗涤用于流式细胞术测定和分选。

代表数据

体外激活的PP细胞的FACS分析。
PPs从6 Balb/c小鼠获得，如先前公开的（Pastori等人，2014）。详细地，使用两种不同的免疫方案：3只小鼠接受一次鼻内（i.n.），而其它3只小鼠接受一次腹膜内（i.p.）免疫。氢氧化铝用作i。 p。免疫。对于免疫使用Flock House病毒（FHV），其中引入CCR5的外部环（7个跨膜蛋白，属于趋化因子受体家族和HIV-1的共同受体）。详细的免疫方案已在Pastori等人（2014）中描述。
切除后，将PP机械解离，并如上所述用PMA和离子霉素体外激活PP细胞。 24小时后收获细胞并用针对B细胞活化的一些标志物的抗体染色如图2所示，CD138和CD40/CD19表达指示两种方案的B细胞活化表型。

图2.PMA /离子霉素活化24小时后CD19，CD40，CD138的表达和CD19/CD40在PP细胞上的共表达。阳性细胞的百分比是指淋巴细胞（在FSC对SSC情节）。显示了平均值和标准偏差。

笔记

关于小鼠尸检，肠移植和派克的图像和更详细的信息可以在Scudamore（2013）中找到。
从PP或肠淋巴结分离的细胞的产量是时间敏感的。尽可能快地进行分离以获得更好的细胞活力。
与酶相比，PP的机械解离产生较低的产量，但其不改变表面抗原的表达，因此，在随后的FACS分析或体外实验中更好。机械解离还导致附着的附属细胞，例如单核细胞和/或树突细胞的相对损失，因此，为了分离这些细胞类型，酶解离是优选的。

食谱

注意：准备并保持所有溶液在无菌条件下。

PBS + 2％Pen/Strep
对于100ml，混合98ml PBS和2ml Pen/Strep
使用前在4°C冷藏
RPMI + 2％Pen/Strep
对于100ml组合98ml RPMI和2ml Pen/Strep
使用前在4°C冷藏
完成媒介
对于100ml组合物，将89ml RPMI（含谷氨酰胺），10ml热失活的FBS和1ml Pen/Strep
使用前在37°C水浴中温暖

致谢

我们感谢玛丽亚Rescigno她帮助鼠标PPs隔离。这项工作是由意大利卫生部，支持40H15。

参考文献

Guo，Z.，Jang，MH，Otani，K.，Bai，Z.，Umemoto，E.，Matsumoto，M.，Nishiyama，M.，Yamasaki，M.，Ueha，S.，Matsushima，K.，，T.and Miyasaka，M。（2008）。 CD4 ⁺ CD25 ⁺调节性T细胞在小肠固有层中显示效应子/记忆表型。 Int Immunol 20（3）：307-315。
Lefrancois，L.and Lycke，N。（2001）。小鼠小肠上皮内淋巴细胞，淋巴集结和固有层细胞的分离。 em> Curr Protoc Immunol Chapter 3：Unit 3 19.
Li，Y.Y.Y.，Yang，Y.，Bao，M.，Edwards III，C.K.and Parnes，J.R。（2006）。使用不同活化刺激的小鼠脾B淋巴细胞活化诱导体外剪接肿瘤坏死因子-α核前mRNA。 Mol Immunol 43（6）：613-622。
Muul，L.M.，Heine，G.，Silvin，C.，James，S.P.，Candotti，F.，Radbruch，A.and Worm，M。（2011）。测量培养的淋巴细胞的增殖反应。 Curr Protoc Immunol Chapter < em> 7：Unit7 10.
Pastori，C.，Diomede，L.，Venuti，A.，Fisher，G.，Jarvik，J.，Bomsel，M.，Sanvito，F.和Lopalco，L。在没有组织病理学改变的Peyers斑块中诱导HIV阻断抗CCR5 IgA。 88（7）：3623-3635。
Scudamore，C.L。（2013）。 A Practical Guide to the Histology of the Mouse，John Wiley& 儿子。
Sheridan，B.S。和Lefrancois，L。（2012）。从小肠组织中分离小鼠淋巴细胞。/em> 3：Unit 3 19.
Thornton，A.M。（2003）。使用T和B细胞分级磁珠。 Curr Protoc Immunol 3 .5 A. 1-3.5 A. 11.