材料和试剂

植物表达过氧化物酶体靶向的GFP（Mano等人，2002）
纤维素酶Onozuka R-10（Yakult Honsha）
Macerozyme R-10（Yakult Honsha）
MES
甘露醇
酶溶液（见配方）
洗涤溶液（见配方）

设备

时间磁带（Time Med）
修补胶带（3M）
铝箔
20ml烧杯
振动器
巴斯德移液器
试管
旋转式转子离心机
共焦激光扫描显微镜（Zeiss，型号：LSM510 META）
MAS涂层玻璃载片（超级霜）（Matsunami Glass，目录号：S9441）
盖玻片（24×60 No.1，0.12-0.17mm）（Matsunami Glass，目录号：C024601）

软件

用于Windows的NIH ImageJ软件1.46（ http://imagej.nih.gov/ij ）
注意：ImageJ也可在Mac OS X和Linux上使用。

程序

原生质体分离
有几种原生质体分离的方法。以下方法基于Tape-Sandwich方法（Wu等人，2009），稍作修改。
1. 收集3周龄拟南芥植物的第六叶和第七叶。四叶对于这个实验是足够的。
2. 通过剥离使用两种类型的胶带，时间去除叶表皮磁带和修补磁带。将时间胶带和修补胶带放在上面侧和叶的下侧。轻轻取出修补胶带剥离叶片的表皮。有关详情，请参阅Wu 等（2009）。
  注意：一旦找到兼容的磁带集，您可以轻松，干净地剥离表皮。但是，有即使在同一产品中也会带来不便。
3. 把带叶的时间胶带放入带有5ml酶溶液的烧杯中（见下面的食谱）。
4. 将杯子包裹在铝箔中，避免轻微损伤和温和在室温下摇动（〜40rpm）30分钟。在此步骤中，单元格壁用酶溶液消化，并分离原生质体从叶子
5. 通过倾析将含原生质体的溶液轻轻转移到试管中
6. 在室温下使用摇摆转子在100×g下旋转1分钟。
7. 弃去上清液，轻轻加入2ml洗涤溶液（见下面的配方）。
8. 在室温下使用摇摆转子在100×g下旋转1分钟。
9. 重复步骤A7-8。
10. 弃去上清液，轻轻加入1 ml洗涤液。
通过显微镜获取原生质体图像
1. 使用巴斯德移液管小心地将原生质体溶液放在MAS涂层的载玻片上
2. 在幻灯片上轻轻盖上盖子。
3. 登上准备的标本在显微镜和焦点。寻找直径40-55μm的原生质体。
4. 从上到下（或中间）位置获取原生质体的Z系列图像。
  我们使用LSM510的条件如下：氩激光488nm，发射过滤器BP505-550,40x干物镜（Plan-Neofluar 40x/0.75），1×变焦，像素尺寸为0.22μm。每个焦平面之间的步长为0.887μm。要快速获取图像，请使用"投资回报率"最小化扫描区域
5. 执行Z投影，通过LSM510 META的操作软件在一个图像中编译获取的连续图像注意：原生质体的观察应在一小时内完成分离后，因为分离的原生质体迅速变得不健康，容易爆裂。 Z投影也可以在ImageJ中完成：图像>堆栈> Z项目>最大强度投影。

过氧化物酶体计数

启动ImageJ软件并打开Z投影图像。
使用分析&测量菜单计算每个原生质体的直径。
注意：在计算前需要执行"设置刻度"。点击 "直线"工具并跟踪打开图像的比例尺。走分析>设置缩放，在框中输入距离"已知距离"，选中"全局"，然后单击"确定"关闭窗口

Go插件>分析>单元计数器并手动计数过氧化物酶体（图1）。

图1.使用ImageJ的过氧化物酶计数

注意：对于统计分析，我们计数15-20原生质体。参见表 1和2.有必要确认的直径的平均值控制和目标之间的原生质体几乎相等。在表1的情况，具有小直径的原生质体（样品1）由于直径太小而从分析中消除。小心区分细胞器和噪声，因为信号来自底部低，其中一些被观察为连接信号。为了最小化人的主观性，建议多个人根据相同的数据独立地计数过氧化物酶体盲测。

表1.原生质体中过氧化物酶体的直径和数量

	直径	号码
示例1 ^{* 1}	29.8	31
样品2	36.1	29
样品3	36.6	25
样品4	37.7	47
样品5	40.4	42
样品6	42.0	40
样品7	43.5	59
样品8	44.0	42
样品9	45.0	58
样品10	45.5	49
样品11	45.9	54
样品12	45.9	81
样品13	46.0	45
样品14	47.0	52
样品15	47.3	33
样品16	47.6	66
样品17	47.9	52

^{* 1}具有小直径的原生质体，例如样品1，由于直径太小而从分析中消除。

表2.原生质体中过氧化物酶体的直径和数量的平均值

	直径（D）	号码	n
35	43.6	48.4	16
SD	5.1	14.2
SE	1.3	3.6

食谱

酶溶液
1％（v/w）纤维素酶Onozuka R-10 0.25％（v/w）巨噬酶R-10 0.4M甘露醇 20mM MES（pH 5.7）
洗液
0.4M甘露醇 20mM MES（pH 5.7）

致谢

这是用于测量由Shibata等人（2013）描述的过氧化物酶体的数量的详细方案。

参考文献

Mano，S.，Nakamori，C.，Hayashi，M.，Kato，A.，Kondo，M。和Nishimura，M。（2002）。阿拉伯语中的过氧化物酶体的分布和表征通过用GFP可视化：动态形态和肌动蛋白依赖性运动。植物细胞生理学43（3）：331-341。
Shibata，M.，Oikawa，K.，Yoshimoto，K.，Kondo，M.，Mano，S.，Yamada，K.，Hayashi，M.，Sakamoto，W.，Ohsumi，Y.and Nishimura， 2013）。高度氧化的过氧化物酶体通过拟南芥中的自噬而选择性降解。 > 植物细胞 25（12）：4967-4983。
Wu，F.H.，Shen，S.C.，Lee，L.Y.，Lee，S.H.，Chan，M.T.and Lin，C.S。（2009）。磁带 - 拟南芥三明治 - 更简单的拟南芥 >原生质体分离方法。植物方法 5：16.