材料和试剂

鼠标
RPMI-1640培养基（RPMI）（Life Technologies，目录号：52400-041）
胶原酶I（Worthington Biochemical，目录号：LS004214）
胶原酶IV（Worthington Biochemical，目录号：LS004209）
DNase I（Worthington Biochemical，目录号：LS002060）
Hank's缓冲盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Gibco ）
NH 4 Cl（Merck KGaA）
（Merck KGaA）
EDTA（Duchefa Biochemie）
胎牛血清（FCS）（Life Technologies，Gibco ）
Lymphoprep（Axis-shield，目录号：1114547）
LS colums（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
抗CD11b微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-049-601）
抗CD11c微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-052-001）
纯化的CD16/CD32（FcBlock）（克隆2.4G2）（BD Biosciences，目录号：553142）
PE-Cy7缀合的抗CD11b抗体（克隆M1/70）（BD Biosciences，目录号：552850）
AF647缀合的抗Ly6C抗体（克隆ER-MP20）（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ，目录号：MCA2389A647）
PerCP-Cy5.5-结合的抗I-A/I-E（MHC-II）抗体（克隆M5/114.15.2）（BioLegend，目录号：107626）
FITC缀合的抗Ly6G抗体（克隆1A8）（BD Biosciences，目录号：551460）
PE缀合的抗SiglecF抗体（克隆E50-2440）（BD Biosciences，目录号：552126）
PE缀合的抗CD11c抗体（克隆HL3）（BD Biosciences，目录号：553802）
肿瘤消化介质（见配方）
红细胞裂解缓冲液（参见配方）
MACS缓冲区（参见配方）
排序缓冲区（请参阅配方）
完整介质（见配方）

设备

在10×10cm正方形（螺纹直径70μm）（Spectrum 实验室，目录号：146490）中切割的聚酯过滤器
6孔板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：657185）
10ml注射器（Omnifix，目录号：473203）
BD Falcon 50ml聚丙烯管（BD Biosciences，目录号：2070）
BD Falcon 15ml聚丙烯管（BD Biosciences，目录号：2096）
BD Falcon 5ml聚丙烯圆底管（BD Biosciences，目录号：352063）
无菌培养罩
外科剪刀和镊子
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
移液器
离心机
振动器
显微镜
MidiMACS ^TM Separator and MultiStand（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-301）
多色FACS分选仪（BD Biosciences，Aria流式细胞仪）

程序

制备肿瘤单细胞悬液
1. 牺牲当肿瘤已达到所需直径时（如从瞬间肿瘤变得明显，可以分析。最大肿瘤直径取决于道德委员会设定的限制，可能在不同的国家变化），并通过把它的爪子限制在一个泡沫表面使用注射器针。从平行切口基部的尾巴沿着鼠标的腹部和颈部的颈部爪不刺穿腹膜。轻轻拉回皮肤和将其固定到泡沫表面以显露肿瘤。这里，LLC肺癌被用作示例，然而该协议适用于所有实体瘤（图1A）。
2. 切除肿瘤从皮肤和身体。尝试删除尽可能多的肿瘤周围的组织可能并注意排除引流淋巴结（图1A）。
3. 将收获的肿瘤存储在2ml RMPI培养基中的6孔板在冰上，直到消化程序（图1B）。
4. 使用剪刀或a。切割小块（1-1.5毫米）肿瘤解剖刀，随后在相同的孔中加入1ml消化培养基随后在37℃孵育25分钟（图1C）
5. 粉碎肿瘤用柱塞注射10ml注射器，加入5ml RPMI培养基通过用10ml移液管彻底吹打匀化。
6. 过滤将肿瘤悬浮通过70μm无菌尼龙纱布进入无菌 50ml锥形管，并用10ml RPMI培养基洗涤纱布
7. 在4℃下以450xg离心50分钟的管子6分钟，弃去上清液。
8. 通过将沉淀重悬在4ml中来除去红细胞红细胞裂解缓冲液，并在室温下放置2分钟。
9. 通过加入12ml RPMI培养基中和，并转移悬浮液到通过70μm无菌尼龙纱布的新的50ml管。
10. 在4℃下以450xg离心50分钟的管子6分钟，弃去上清液。
11. 使用台盼蓝计数活细胞并重悬细胞沉淀在Lymphoprep中，浓度为约1-2×10 7个细胞/ml，并将悬浮液转移到无菌的15ml管（6） ml /管）。用6 ml缓慢小心地覆盖此细胞悬液 RPMI获得两相梯度（图1D）。
12. 在室温下以800×g离心梯度30分钟，不加速或断裂。
13. 仔细收集中间相和上相含有 RPMI培养基和尽可能少的Lymphoprep污染（图 1E）。间期包含活细胞并富含骨髓细胞，并转移到新的无菌15ml管中。通过填充洗涤15 ml管，用MACS缓冲液至上部，以800×g离心5分钟在4℃并弃去上清液
14. 将细胞以10 8细胞/ml的浓度重悬于MACS缓冲液中
  
  图1.肿瘤单细胞制备。 A。 LLC荷瘤小鼠。箭头指向引流淋巴结，在这种情况下是腹股沟淋巴结。 B.在6孔板中的肿瘤在2ml RPMI培养基中。 C.肿瘤消化后。 D.制备梯度。 E.离心后的梯度具有清晰可见的界面。
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的纯化
1. 加入5μl等份的抗CD11b磁性微珠/10 10个细胞并在轨道摇床上以50rpm在4℃下孵育20分钟
2. 通过加入10ml MACS缓冲液洗涤，在4℃下以450xg离心6分钟，弃去上清液。
3. 将LS柱放在连接到磁性的MidiMACS分离器中 MultiStand并通过将3ml MACS缓冲液放在顶部来洗涤。的液体在重力作用下通过色谱柱
4. 重悬沉淀的细胞在1ml MACS缓冲液中，并在其上吸取标记的细胞悬浮液 LS分离柱。通过加入3×3ml MACS洗涤柱缓冲区
5. 从分离器中取出LS柱并洗涤磁性标记的细胞用5ml MACS缓冲液，使用柱塞无菌15 ml管
6. 与大鼠孵育CD11b +细胞悬浮液抗 - 小鼠CD16/CD32（10μg/10 7个细胞）在冰水上孵育20分钟，在以阻断存在于细胞表面上的Fc受体
7. 孵育细胞悬液与荧光标记的抗体（1微克每10个细胞）在冰水上再保持20分钟，防止暴露光。 TAM可以在BD FACS Aria上作为CD11b ^pos Ly6G ^neg SiglecF ^neg Ly6C低级细胞进行分选，分为MHC-II ^高和 MHC-II ^低 TAM亚群（Laou等人，2014）（图2A）。
8. 通过加入10ml MACS缓冲液洗涤，在4℃下以450xg离心6分钟并弃去上清液。
9. 同时预涂5毫升聚丙烯圆底管和15毫升管用热灭活的胎牛血清，分别加入1ml或2μl ml热灭活的胎牛血清。用手轻轻摇动试管热灭活的胎牛血清覆盖整个表面管，并丢弃过量的热灭活的胎牛血清。这将防止细胞粘在管上，从而增强恢复细胞。
10. 将沉淀重悬在1ml分选缓冲液中每10 7个细胞并转移到无菌的5ml聚丙烯中用热灭活的胎牛血清预涂的圆底管
11. 收集排序TAM在15毫升管预热包含3毫升完全培养基的热灭活的胎牛血清。
纯化肿瘤相关树突状细胞（TADC）
1. 每10 7个细胞加入5μl抗CD11c微珠的等分试样，并在轨道摇床上在50rpm下在4℃孵育20分钟。
2. 通过加入10ml MACS缓冲液洗涤，在4℃下以450xg离心6分钟，弃去上清液。
3. 将LS柱放在连接到磁性的MidiMACS分离器中 MultiStand并通过将3ml MACS缓冲液放在顶部来洗涤。的液体在重力作用下通过色谱柱
4. 重悬沉淀的细胞在1ml MACS缓冲液中，并在其上吸取标记的细胞悬浮液 LS分离柱。通过加入3×3ml MACS洗涤柱缓冲区
5. 从分离器中取出LS柱并洗涤磁性标记的细胞用5ml MACS缓冲液，使用柱塞无菌15 ml管
6. 将CD11c +细胞悬浮液与大鼠孵育抗 - 小鼠CD16/CD32（10μg/10 7个细胞）在冰水上孵育20分钟，在以阻断存在于细胞表面上的Fc受体
7. 孵育细胞悬液与荧光标记的抗体（1微克每10个细胞）在冰水上再保持20分钟，防止暴露光。 TADC可以在BD FACS Aria上作为Ly6G ^neg SiglecF ^{neg CD11c pos MHC-II pos}细胞进行分选。注意仅在MHC-II ^最高细胞上门而排除也表达CD11c的MHC-II ^高 TAM，虽然水平低于TADC（图2B）。
8. 通过加入10ml MACS缓冲液洗涤，在4℃下以450xg离心6分钟，弃去上清液。
9. 同时预涂5毫升聚丙烯圆底管和15毫升管用热灭活的胎牛血清，分别加入1ml或2μl ml热灭活的胎牛血清。用手轻轻摇动试管热灭活的胎牛血清覆盖整个表面管，并丢弃过量的热灭活的胎牛血清。这将防止细胞粘在管上，从而增强恢复细胞。
10. 将沉淀重悬在1ml分选缓冲液中每10 7个细胞并转移到无菌的5ml聚丙烯中用热灭活的胎牛血清预包被的圆底管。
11. 收集排序TADC在15毫升管预热包含3毫升完全培养基的热灭活的胎牛血清。
  
  图2. TAM和TADC门控。A. TAM子集可以使用MHC-II门控和Ly6C在CD11b pos Ly6G ^neg SiglecF ^{neg肿瘤单细胞悬浮液中。 B.TADC可以使用在Ly6G阴性肿瘤中的MHC-II和CD11c门控单细胞悬液。}

食谱

肿瘤消化培养基
10 U/ml胶原酶I
400U/ml胶原酶IV
30U/ml DNAse I
所有稀释在HBSS中
分装并在-20°C下冷冻
红细胞裂解缓冲液
8.29g/L NH 4 Cl/h 1 g/L KHCO 3
37.2mg/L EDTA
在pH 7.2下冲洗
MACS缓冲区
汉克缓冲盐溶液
0.5％（v/v）热灭活的胎牛血清 2mM EDTA
排序缓冲区
汉克缓冲盐溶液
0.5％（v/v）热灭活的FCS 5 mM EDTA
完成媒介
罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）-1640
10％（v/v）热灭活的胎牛血清（FCS）
300μg/ml L-谷氨酰胺 100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素 0.02mMβ-巯基乙醇 1mM丙酮酸钠 1 mM非必需氨基酸

致谢

作者感谢FWO-Vlaanderen，"Stichting tegen Kanker"和"Vlaamse Liga tegen Kanker"的支持。

参考文献

Laoui，D.，Van Overmeire，E.，Di Conza，G.，Aldeni，C.，Keirsse，J.，Morias，Y.，Movahedi，K.，Houbracken，I.，Schouppe，E。和Elkrim，Y （2014）。肿瘤缺氧不会驱动肿瘤相关巨噬细胞的分化，而是微调M2- like macrophage population。 Cancer Res 74（1）：24-30。
Laoui，D.，Van Overmeire，E.，Movahedi，K.，Van den Bossche，J.，Schouppe，E.，Mommer，C.，Nikolaou，A.，Morias，Y.，De Baetselier， Ginderachter，JA（2011）。癌症中的单核吞噬细胞异质性：在肿瘤部位不同的亚群和激活状态。 Immunobiology 216（11）：1192-1202
Maohedi，K.，Laoui，D.，Gysemans，C.，Baeten，M.，Stange，G.，Van den Bossche，J.，Mack，M.，Pipeleers，D.， De Baetselier，P。和Van Ginderachter，JA（2010）。不同的肿瘤微环境包含源自Ly6C（高）单核细胞的巨噬细胞的功能不同亚群。 Cancer Res 70（14）：5728-5739。