材料和试剂

细胞（悬浮细胞）
甲醛（Merck KGaA，目录号：K43634203208）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
封闭试剂（Roche Diagnostics，目录号：11096176001）
马来酸（Sigma-Aldrich，目录号：M0375）
去离子甲酰胺（Merck KGaA，目录号：K25761484902）
Tris-HCl
绿色荧光Alexa Fluor 488（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：A-11034）或红色荧光Alexa Fluor} 594 （Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：A-11005）}
乙醇（Kemetyl，目录号：200-578-6）
Cy3-TelG（PANAGENE，目录号：F1006）
FITC-TelC（PANAGENE，目录号：F1009）
DAPI（Vector Laboratories）
固定缓冲区（参见配方）
渗透缓冲液（参见配方）
IF阻塞缓冲区（参见配方）
FISH阻断溶液（参见配方）
马来酸缓冲液（参见配方）
PNA探针（参见配方）
杂交溶液（参见配方）
洗涤液（见配方）
PML抗体（参见配方）
二抗（见配方）
脱水溶液（参见配方）
安装介质（参见配方）

设备

显微镜载玻片（76×26mm）
盖片（优选圆形19mm直径）
Cytospin或载玻片离心机（Cytospin3 SHANDON）
带白色过滤卡的Cytospin漏斗
金属支架
疏水屏障笔（ImmEdge Pen，型号：H-4000）
热板预热至80°C
Coplin瓶子
湿室

程序

用PBS洗涤悬浮细胞一次，并在室温下制备0.5×10 6个细胞/ml PBS的稀释液。
预先标记幻灯片，并用ImmEdge笔制作一个小的疏水屏障圈（直径约1.3厘米），放置细胞的区域，让它在细胞离心前干燥。（疏水圈将用于填充用于固定，透化和阻断缓冲液的缓冲液。）
如图1所示，准备安装有过滤卡和细胞离心柱漏斗的载玻片在金属支架上

图1.该图说明了cytospin
的幻灯片的准备工作
在每个漏斗中加载至100μl制备的细胞，并以600rpm旋转1分钟。
注意：如果该方法适用于盖玻片上生长的贴壁细胞，则可以跳过步骤1-4。
从固定器上取下载玻片，让细胞的水分干燥几秒钟，然后在室温下用固定缓冲液固定10分钟。
用PBS洗涤细胞2×5分钟
在室温下用透化缓冲液渗透细胞5分钟。
取出透化缓冲液，并在保湿室中用IF封闭缓冲液孵育细胞1小时
取出IF阻断缓冲液，并将细胞在潮湿的室中与新鲜的含有PML抗体的IF封闭缓冲液在室温孵育2小时或在4℃过夜。
在摇床上用PBS轻轻洗涤细胞3×10分钟。（洗涤步骤可以在任何玻璃或塑料显微镜载玻片染色瓶中进行。）注意：在接下来的步骤中，幻灯片应该避光。
孵育细胞在潮湿室与第二抗体30分钟
在摇床上用PBS轻轻洗涤细胞3次，每次10分钟
重新固定细胞在室温下固定缓冲液5分钟。
在PBS中每次洗涤细胞3×10分钟
将含有乙醇系列的连续70％，95％，100％EtOH的细胞脱水5分钟。
完全抽吸乙醇，让玻片在黑暗中干燥几分钟。
在每个载玻片上放置一滴含有PNA探针的杂交溶液，并用盖玻片覆盖
通过将载玻片放置在预热的热板上，在80℃下使杂交溶液中的探针变性10分钟。
在室温下孵育载玻片2小时。
在洗涤溶液中洗涤载玻片2×15分钟。
在PBS中洗涤载玻片3 x 5分钟。
在室温下将载玻片风干10分钟。
用一滴Vectashield装载幻灯片，盖上盖玻片。
用清澈的指甲油密封盖玻片边缘，让其干燥
保持幻灯片在4°C在黑暗中直到显微镜
使用共焦显微镜作为来自与端粒信号共定位的PML体的荧光信号可视化APB。
包含两个或更多个APB的细胞可以被评分为ALT阳性细胞（图2）

代表数据

图2.代表性的显微照片说明在间期中APB阳性的U2OS细胞。箭头显示三个APB病灶，其中绿色PML信号与红色端粒信号共定位。在一些细胞系中，PML抗体产生弱扩散荧光背景，其容易地与PML体的明亮荧光区分开。

笔记

与缓慢生长的原代细胞相比，快速增殖的癌细胞通常具有更短的端粒和更高的蛋白质表达。这可能导致高背景的免疫荧光和弱端粒信号FISH。为了改进该方法，应该减少与初级PML抗体的孵育时间，并且应该使用更少的漂白端粒探针。 Cy3-TelG通常比FITC-TelC更长，Alexa Fluor 488比Alexa Fluor 594产生更少的背景。在具有短端粒和高背景信号的细胞中，Cy3-建议使用TelG和Alexa Fluor ^® 488。

食谱

固定缓冲区
3.7％甲醛的PBS溶液（37％市售储备溶液的10倍稀释液）将PH调整为7.5
固定剂应该为每个实验准备好
渗透缓冲液
0.5％Triton X-100的PBS溶液中
IF阻塞缓冲区
1％BSA和0.1％Triton X-100的PBS溶液中
FISH阻断溶液
在马来酸缓冲液中的10％封闭试剂：将10克封闭试剂溶解在100毫升马来酸缓冲液中用NaOH调节pH至7.5，储存于4℃
马来酸缓冲液
100mM马来酸和150mM NaCl，在dH 2 O中
PNA探头
Cy3-TelG：Cy3-OO-TTAGGGTTAGGGTTAGGG 3'
储备浓度：53μM，在dH 2 O中
FITC-TelC：FITC-OO-CCCTAACCCTAACCCTAA 3'
储备浓度：111μM，在dH 2 O中
将股票存储在4°C的黑暗
杂交溶液
70％去离子甲酰胺 0.5％FISH封闭试剂（来自10％储液）
10mM Tris-HCl（pH7.2） PNA端粒探针：FITC-TelC（来自库存的1：500-1,000稀释）或Cy3-TelG（来自库存的1：3,000-5,000稀释）
准备新鲜，防止光照
洗涤溶液
70％甲酰胺 10mM Tris-HCl（pH 7.2），在dH 2 O中
PML抗体
在IF阻断缓冲液
中使用1：100-200稀释可以使用单克隆或多克隆PML抗体
二抗
绿色荧光Alexa Fluor 488或红色荧光Alexa Fluor ^® 594在IF阻断缓冲液中以1:1000稀释。
脱水溶液
乙醇系列70％，95％和100％
安装介质
含有DAPI的Vectashield包埋介质

致谢

所述协议的一些原理已经从Titia de Lange的实验室的协议中提取。这项工作得到瑞典癌症协会和瑞典斯德哥尔摩Karolinska研究所授予的资助。

参考文献

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