材料和试剂

Milli-Q质量水（dH 2 O）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：02854）
乙腈（Sigma-Aldrich，目录号：271004）
（Merck KGaA，目录号：5153）
NaCl（Merck KGaA，目录号：106404.1）
（Carlo ERBA Reagents，目录号：433381）
NaN 3（Merck KGaA，目录号：822335）
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
H sub 3 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：P6560）

酶
来自猪胰腺的α-淀粉酶（Sigma-Aldrich，目录号：A3176）
来自绿色木霉的木聚糖酶M1（Megazyme International，目录号：E-XYTRI）
来自芽孢杆菌属（Megazyme International，目录号：E-LICHN）的lichenase [内切-1,3（4）-β-D-葡聚糖酶]

MALDI基质制备
2,5-二羟基苯甲酸（DHB）（Sigma-Aldrich，目录号：85707）
N，N-二甲基苯胺（DMA）（分析试剂级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：121-69-7）

缓冲区和媒体
70％乙醇（见配方）
0.1 M NaOH（见配方）
25mM CaCl 2（参见配方）
α-淀粉酶的缓冲液（参见配方）
1mg/mlα-淀粉酶（参见配方）
460 U/ml木聚糖酶M1（见配方）
4.6U/ml木聚糖酶M1（参见配方）
200 U/ml Lichenase（参见配方）
2 U/ml Lichenase（参见配方）
40℃时饱和K <2> SO 4（参见配方）
50％乙腈（见配方）
MALDI基质制备（参见配方）

设备

Vibratome（MICROM，型号：HM 650V）
内部设计的喷涂机器人
注意：机器人通过将从LCQ Advantage质谱仪（Thermo Fisher Scientific）卸下的电喷射探针适配到X，Y，Z机器人臂（FISNAR，F4300N）（参见图1）来构建（参见注释2 ）。

图1.内部设计的喷涂机器人用于酶应用。右侧面板代表左图所示的虚线矩形区域的放大视图。
注射泵输注0.2μl/h至500ml/h（Thermo Fischer Scientific，目录号：12486350）
500μl玻璃注射器（Hamilton，型号：Gastight 1750）
热振荡器（Eppendorf，Thermomixer compact）
孵化器（THERMOSI，型号：SR 300）
家庭设计的孵化室
注意：这包括橡胶垫圈密封的玻璃容器（具有盖的罐子，KORKEN，IKEA of Sweden，直径11cm;高10.5cm，体积0.5L），其中放置了50ml玻璃烧杯和一套的重量（例如石块）（见图2）。需要一组重量以保持玻璃杯不漂浮。

图2.家庭设计的孵化室示意图
pH计（pHenomenal ，型号：pH 1000L，配备pHenomenal 221电极）

其他设备
胶水（Loctite Super Glue Ultra Gel）
粘性碳带（8mm×20μm）（Agar Scientific，目录号：AGG3939）
氧化铟锡（ITO）载玻片（Bruker，目录号：237001）（参见注释3）
艺术漆刷（大约直径：3-4毫米）
剃刀刀片（Gillette，Bleue extra）
培养皿（90mm×14.2mm）（Thermo Fischer Scientific，目录号：5184E）
Whatman滤纸（直径90mm）
1.5 ml Eppendorf管（Eppendorf安全锁质量）
2ml塑料巴斯德吸管（Thermo Fischer Scientific，目录号：13984）
Kimwipes纸（Kimberly-Clark）

额外的，MALDI成像实验所需的
ImagePrep雾化机器人（Bruker Daltonics）（见图3）

图3. ImagePrep雾化机器人
MTP滑动适配器II（Bruker Daltonics，目录号：235380）（参见注释4）

程序

小麦籽粒的再水化（Philippe等人，2006）。
1. 胚芽部分（参见图4）用剃刀刀片移除，垂直于颗粒的折痕区（纵轴），和被丢弃。
  
  图4.小麦籽粒和剃刀刀片的位置在小麦胚芽去除期间。粮食的两面都很容易呈现定位胚芽，刷子和褶皱区域
2. 然后将谷粒放置在用dH 2 O润湿的Whatman滤纸上的培养皿中，并在+ 4℃下放置24小时。
  注意：对于年轻的谷物，其被自然水合，所以完全水化程序被跳过
制备70μm薄的小麦籽粒横截面。
1. 该步骤通过使用根据的Vibratome仪器进行指导手册（Thermo Fisher 科学，2009）。颗粒用一些胶固定在磁体上板的Vibratome。颗粒的取向应该是这样的晶粒的纵轴垂直于磁体放置盘子。 Vibratome仪器的设置如下：频率： 60; 振幅：1.2; 速度：12.
2. 一系列400微米厚的切片切割并丢弃，直到谷物的表面变平平行于Vibratome仪器的剃刀刀片。
3. 瘦（大约70μm），然后放置立即加入装有70％乙醇的Eppendorf管中。他们是储存在4℃直至进一步处理。
去除淀粉。
1. 使用油漆刷抓住小麦横截面并转移加入到装有0.5ml 1mg/mlα-淀粉酶的干净的Eppendorf管中解。允许将其在40℃下孵育24小时热振荡器。
2. 通过转移小麦十字架彻底冲洗切片放入装有1ml dH 2 O的干净的Eppendorf管中。重复这一步两次。每次样品转移后在水中清洗刷子。
  注意：此步骤旨在避免淀粉的任何水解内源酶活性，其将产生一些类似的葡聚糖如从细胞壁BG的水解预期的那些（另外，当使用MALDI质谱法进行进一步分析时的组织，淀粉对其产生强烈的抑制作用信号）。
将横截面放置在ITO玻璃板上（见注5）
1. 准备接收横截面的ITO玻璃板：
  1. 放置一小块胶带在胶带的位置横截面将沉积在ITO玻璃板上;
  2. 用巴斯德吸管，将一滴水放在磁带上。
2. 然后，用油漆刷，抓住Eppendorf的横截面管。倾斜水滴表面的横截面，允许其从漆刷分离。继续非常轻柔，所以避免任何中断或横截面的任何变形（图5）。
  
  图5.小麦部分抓取a）和沉积到ITO板（b，c）期间的颗粒截面的定位。
  
  用Kimwipes组织轻轻取出多余的水。使样品在室温下干燥（约30分钟）（见图6）
  
  图6.其上带有小麦部分的ITO板的外观
3. 将ITO玻璃板安装到MTP Slide Adapter II（Bruker）根据制造商的说明[可得自Bruker，（2012）]。
水解酶在横截面上的应用。
1. 此步骤使用自制机器人（见图1和注2）。目的是通过使用将可控体积的酶递送到组织上喷枪装置，使得细小的酶滴施加在其上组织，从而限制释放的寡糖的扩散在组织上消化。
2. 喷洒酶通过连接安装在机器人臂上的电喷雾探针实现到以恒定流量递送酶溶液的注射泵速率600μl/h。
  1. 用氮气（1.5×10 5 Pa）气动辅助喷雾。
  2. 电喷雾探针的针尖与ITO板之间的距离为3cm（Z轴）。
  3. 使用"刷矩形"后的X，Y沉积图案（图7）。
  4. 机器人头的移动速度设定为5mm/s。
  5. 其他参数（X和Y轴起点和终点坐标，体积放入注射器中的酶，喷雾周期数）以确保机器人一致地沉积0.3微升的酶（4.6 U/ml内切-1,4-β-木聚糖酶或2U/ml地衣多糖酶）/mm 2喷雾面积（对应于0.0014U木聚糖酶和0.0006U淀粉酶/mm 2组织）。
    酶可以单独，连续或混合使用。
    注意：内切-1,4-β-木聚糖酶用于AX水解，而地衣多糖酶用于混合连接BG水解。
    
    图7.用于酶沉积的"刷矩形"图案。 X和Y. 根据坐标确定"开始"和"结束"位置必须被酶覆盖的表面。
孵化。
1. 将前述步骤中酶覆盖的小麦横截面在40℃下孵育4小时。
2. 为了防止液体蒸发太快和酶变成非活性的，通过将ITO板放入a中来保持湿气氛密封的孵育室，其填充有150ml饱和K 2 SO 4和NH 4 在40℃预温育。
3. 将ITO板放置在50的顶部 ml玻璃烧杯用石头称重并安装到玻璃孵化器（图2）。
4. 孵育后，从孵化室中取出组织，并在空气中干燥（约15分钟）。
用于MALDI MS测量水解截面的附加步骤：沉积DMA-DHB MALDI基质。
1. 该步骤用自动振动蒸发系统进行从Bruker（ImagePrep，参见图3）由制造商提供（Bruker Daltonik，2007）。
2. 的设置如下（参见注释6）：1 ^st相：15个循环：12％喷雾功率; 20％喷雾调制; 2秒喷涂时间; 15秒孵育时间; 30秒干燥时间。 2个阶段：40个循环：20％喷雾功率; 25％喷雾调制; 2秒喷涂时间; 30秒孵育时间; 60秒干燥时间。在整个过程期间，在2×10 5 Pa下提供N 2流。

代表数据

图8给出了可以通过该方法预期的结果类型的代表性实例。如通过MALDI MS成像所测量的，描绘了通过内-1,4-β-木聚糖酶在组织内水解后释放的AX寡糖的定位。

图8.内切-1,4-β-木聚糖酶原位水解后小麦横截面上释放的AX寡糖的MALDI MS成像。红色像素表示DP5的阿魏酰化AX（聚合度）的位置5）存在和绿色像素表示DP5和DP6的非阿魏酸化AX寡糖。

食谱

70％乙醇
将700ml乙醇置于玻璃瓶中，用dH 2 O/dm 2完成至1000ml
0.1 M NaOH
称重0.4g NaOH并溶解在100ml dH 2 O中
25mM CaCl 2。称取0.018g CaCl 2·2H 2·2H 2 O并溶解在5ml的dH 2 O中。
α-淀粉酶的缓冲液（具有2mM NaCl和0.25mM CaCl 2的20mM磷酸钠缓冲液，pH 6.9，含有0.02％NaN 3作为稳定剂）将450ml dH 2 O置于玻璃瓶中，并加入
1.15g H sub 3 PO 4 4/
0.058g NaCl
5ml 25mM CaCl 2·6H 2 O 充分混合并用0.1M NaOH将pH调节至6.9 用dH 2 O完全达到500ml
加入0.1g NaN 3
储存在+4°C
1mg/mlα-淀粉酶将10毫克α-淀粉酶溶解在10毫升α-淀粉酶缓冲液中
460U/ml木聚糖酶M1 / 将80μldH 2 O置于干净的Eppendorf管中
加入20μl的木聚糖酶M1（2,300 U/ml）的生产库存
在取样前轻轻摇动
4.6U/ml木聚糖酶M1 将990μldH 2 O置于干净的Eppendorf管中
加入10μl460U/ml木聚糖酶M1 /
200U/ml地衣淀粉酶放置80微升的dH 2 O在干净的Eppendorf管中。
加入20μl地衣霉素（1,000 U/ml）的生产库存
在取样前轻轻摇动
2 U/ml地衣淀粉酶将990μldH 2 O置于干净的Eppendorf管中
加入10μl的200 U/ml lichenase
在40℃下的饱和K 2 SO 4 称取75g K 2 SO 4并溶于500ml dH 2 O（温热至40℃，搅拌直至完全溶解）
50％乙腈将250 ml乙腈放入玻璃瓶中
用dH 2 O完全达到500ml
MALDI基质制备
称重500 mg DHB
溶于5ml 50％乙腈中加入100μlDMA
注意：DMA与皮肤接触并有怀疑致癌的毒性。穿戴防护手套，防护服，眼睛防护和面部防护。在通风橱下进行。

笔记

该方案在来自普通小麦属的多个品种的成熟小麦谷粒（700D）上进行：Recital，Malacca，Virtuose，Magdalena，Crousty，Thesee，Baltimore，Sisley，Aligre和Tamaro。
同样的方案也在年轻的发育阶段（245D）从栽培品种Recital的种子进行
自制机器人的基本思想是将喷枪型装置放置在X，Y，Z机器人手臂上，并且能够控制通过喷枪的液体流速。为此，我们从旧的LCQ Advantage质谱仪上拆下了Electrospray探针，并将该探针调整为FISNAR 4300N机器人。通过探针的流速由注射泵控制，递送典型的流速为1-100μl/min。氮气用作同轴雾化气体，压力为1.5×10 5 Pa。
FISNAR 4300N机器人由示教器（Teach Pendant）控制，可以对酶沉积的运动模式进行编程。程序包括定义开始和结束位置（由X，Y，Z坐标定义），机器人手臂运动的模式和速度。 "刷矩形"模式是可用模式之一，是我们在实验中使用的模式。如图7所示。FISNAR 4300N机器人的编程和使用在（FISNAR，2012）中有很好的解释。
ITO玻璃板：这些板具有导电侧（由氧化铟锡涂布）。在我们的情况下，通过随后在水解组织上进行的MALDI质谱测量来强制使用这些导电板。然而，原则上可以使用具有相同尺寸（75×25×0.9mm）的任何玻璃板
玻璃载玻片适配器（MTP载玻片适配器II）：该适配器由Bruker提供，以将ITO玻璃板引入Autoflex III MALDI质谱仪。其在本文中用作用于使用自制喷洒机器人执行的所有步骤的方便的保持器。但是，可以使用相同尺寸（12.8 x 8.8厘米）的任何矩形支架。
注意，保持组织内消化的可重复性的最关键的步骤是在ITO板上转移组织（过程4）。它必须非常仔细地进行以避免组织细胞壁网络的任何损伤。几个部分（3到4）通常必须沉积，以确保至少其中一个是良好的质量（这也取决于小麦品种和种子的发展阶段。没有其他的骗子而不是经验！。酶的应用由机器人自动进行，因此该步骤的再现性高（不依赖于板上的部分的位置）。然而，建议为该步骤制备新鲜的酶溶液。我们的经验是这些点是结果方差的主要原因（据我们基于MALDI MS的检测方法估计其为14％）。
ImagePrep装置通过振动叶片（即，具有针孔的不锈钢薄片）蒸发MALDI基质产生气溶胶。这些孔在几次使用后可能堵塞或膨胀。可以由操作者调节设置（喷射功率，例如），以确保组织与MALDI基质的类似涂层，即使刀片已经使用多次。然而，我们建议在十次使用后（或每当它看起来损坏时）更换振动刀片，以确保MALDI基质的可重复应用。

致谢

这项工作部分通过来自INRA（法国国家农业研究所）和AgreenSkills的博士后研究金（DušanVeličkovic）得到支持。我们非常感谢Fabienne Guillon和Luc Saulnier（INRA Biopolymers，Interaction，Assemblies，Nantes，法国）对小麦细胞壁酶水解的有益讨论。该协议是先前在Veličkovic等人（2014）中描述的协议的修改版本。

参考文献

FISNAR（2012）。 F4000N系列机器人操作手册。

Philippe，S.，Robert，P.，Barron，C.，Saulnier，L.and Guillon，F.（2006）。在谷物发育过程中在小麦胚乳中沉积细胞壁多糖：傅立叶变换红外显微光谱研究。 a A> J Agric Food Chem 54（6）：2303-2308。

Saulnier，L.，Guillon，F。和Chateigner-Boutin，A.L。（2012）。小麦籽粒中的细胞壁沉积和代谢。谷物科学em（56）（1）：91-108。

Thermo Fisher Scientific（2009）。带有振动刀片的Thermo Scientific Microtome MICROM HM 650V：说明书。

Veličković，D.，Ropartz，D.，Guillon，F.，Saulnier，L.和Rogniaux，H。（2014）。关于小麦籽粒发育过程中细胞壁多糖的结构和空间变异性的新见解，通过MALDI质谱成像显示。 65（8）：2079-2091。