材料和试剂

A。 baumannii（ATCC，目录号：17978）
大肠杆菌（大肠杆菌）（ATCC，目录号：25922）
Mueller Hinton肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：70192）
替加环素（Wyeth，目录号0220620-09-7）
NaCl（MDBio，目录号：101-1647-14-5）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P1147）
（，目录号：3828-01）
（J.T.Baker ^®，目录号：4921-07）
HCl（J.T.Baker ，目录号：9535-03）
胰蛋白胨（Pronadisa，目录号：1612）
酵母提取物（Pronadisa，目录号：1702）
阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤（CAMHB）（参见食谱）
PBS（1升）（见配方）
溶菌酶肉汤（LB）（参见食谱）

设备

50ml聚苯乙烯培养管（无菌）
分光光度计测量细胞培养物的吸光度（OD 600）
37°C摇动和静态培养箱
多通道移液器（体积范围10μl-1,000μl）
1.5 ml Eppendorf管
离心机
1 ml比色杯

程序

抗生素储备液的制备和稀释范围
1. 从制药公司获取抗生素粉并记录的相关信息，包括到期日期，效力，稳定性和溶解度。
2. 准备1毫升10mg/ml替加环素储备溶液。
3. 选择合适的抗生素浓度范围进行测试为 A。 baumannii （如果有的话）。如果范围不可用，则为最大浓度512μg/ml和用CAMHB连续稀释的浓度溶液。最低稀释浓度取决于可能的最小抑制浓度。 0.125μg/ml是最低的可能的稀释浓度
4. 得到不同的测试浓度，10倍最大浓度的溶液制备用微量移液管分配适量的储备溶液并用CAMHB溶液稀释。
  例如，为了得到1ml5120μg/ml溶液，分配0.512ml储备溶液并用0.488ml CAMHB溶液稀释。
接种物的制备
1. 溶解单个菌落的 A。 baumannii ，从LB中挑选条板，在3ml LB肉汤中，并在37℃，220rpm温育过夜。
2. 使用分光光度计检查OD <600>（OD OD 600 = 10 9 CFU/ml）。
3. 用LB肉汤稀释细菌溶液以获得0.1OD 600的悬浮液，并在37℃，220rpm温育直到对数中期（〜2小时）。
4. 将1毫升中对数期细菌溶液放入1.5毫升Eppendorf管中，在6,000rpm离心5分钟，并用1ml PBS溶液洗涤。重复洗涤程序两次。
5. 用1ml CAMHB溶液溶解细菌沉淀。
6. 得到100微升以上细菌溶液，并与900微升PBS混合，然后用分光光度计检查OD <600>。细菌浓度可以从测量值x 10推导出来。
7. 用CAMHB溶液（1OD 600至10 10 CFU/ml）将细菌浓度调节至1×10 7 CFU/ml。
接种和孵化
1. 混合50μl调整的鲍曼不动杆菌细菌溶液（1×10 7 CFU/ml），850 μlCAMHB和100μl10次连续测试抗生素的溶液浓度。使用 E。大肠杆菌ATCC25922细菌溶液控制
2. 使用900微升CAMHB和100微升10时间序列的解决方案测试的抗生素浓度用于OD 600测量比较作为a 负控制。
3. 在37℃，220rpm孵育20-24小时。
阅读和解释
1. 用分光光度计检查OD <600>。
2. 读取MIC端点为最低浓度的抗生素，其中没有可见的细菌生长（裸眼无溶液浊度），和测量的和背景OD 600的差异小于0.01。

食谱

CAMHB
将23g Mueller Hinton肉汤溶于0.9L蒸馏水中
使用HCl
调节pH至7.2 然后用蒸馏水
填充至1,000 ml 在121℃高压灭菌15分钟，灭菌
并添加了
2ml 10g/L Ca 2+ 2+（8.36g MgCl 2）2·6H 2 O在100ml ddH中的溶液 ₂ O）
在100ml ddH中的1ml 10g/L Mg 2+（3.68g CaCl 2）2·6H 2 O 2·6H 2 O ₂ O）
储存在4°C
PBS（1 L）
8克NaCl
0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4 sub/
调节pH至7.2 在121℃高压灭菌15分钟，灭菌
LB
10g胰蛋白胨
5g酵母提取物
5克NaCl
用ddH sub 2 O填充到1L 在121℃高压灭菌15分钟，灭菌

致谢

该方案的开发由国立台湾大学医院Chu-Tung分院资助。

参考文献

Lin，M.F.，Lin，Y.Y.，Yeh，H.W.and Lan，C.Y。（2014）。 BaeSR双组分系统在调节鲍氏不动杆菌中的作用 adeAB基因及其与替加环素敏感性的相关性。BMC Microbiol 14：119。