材料和试剂

无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，目录号：11836170001）
Bio-Rad蛋白测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D9434）
细菌用蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：P5905）
细菌酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625）
硫酸腺嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：A3159）
Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：93283）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F9037）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
二甲苯Cyanol（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
二硫苏糖醇-DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
硼氢化钠 - NaBH 4（Sigma-Aldrich，目录号：247677）
无菌水
酵母蛋白胨葡萄糖腺苷（YPDA）培养基（参见配方）
磷酸钾缓冲液（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
10x反应缓冲液（参见配方）
凝胶加载缓冲液（参见配方）

设备

0.5mm直径的玻璃珠（Bio Spec Products，目录号：11079105）
Eppendorf管
台式离心机
桌面加热块

程序

酵母细胞提取物的制备
1. 来自酵母酿酒酵母的细胞提取物被制备为描述（Wang等人，1995; Jazwinski，1990），修改为
2. 在酵母蛋白胨葡萄糖腺苷（YPDA）培养基中在30℃下振荡培养酵母培养物过夜（O/N）。
3. 准备新鲜的细胞培养物通过稀释10倍从O/N文化在50ml YPDA培养基。
4. 在30℃下剧烈摇动使细胞生长至稳定期。
5. 当培养物在600nm处达到0.5-1.0的吸光度时，在4℃下以2,000rpm（300rcf）离心细胞5分钟。
6. 用水洗涤细胞沉淀，然后用磷酸钾缓冲液洗涤。
7. 在4℃下以2,000rpm（300rcf）再次离心细胞5分钟
8. 重悬细胞沉淀在500μl冰冷的裂解缓冲液。
9. 将悬浮液转移到预填充的Eppendorf管中预先冷却的珠子（珠与裂解物的比例为1:1），并保持在冰上
10. 通过涡旋珠/裂解物混合物在4℃下破碎细胞：10 2分钟涡流的最大速度的循环与1分钟的循环交替在冰上冷却。
11. 将珠/裂解物混合物在4℃下以全速离心15分钟以除去细胞碎片。
12. 将上清液部分转移到新鲜的Eppendorf管中。我们建议不要收集整个上清液部分留下一部分以防止接触丸粒
13. 确定使用染料试剂通过Bradford测定法制备的提取物的蛋白质浓度。
酵母细胞提取物中的酶活性测定
1. 准备10微升反应混合物，包括1×反应缓冲液和140 nM DNA底物。所用的DNA底物包括腺苷酸化的尿嘧啶碱基在3'-FAM标记的寡核苷酸的5'末端（Caglayan等人， 2014）。
2. 通过向反应混合物中加入如上制备的酵母细胞提取物（至最终量50μg）开始反应
3. 将反应混合物在30℃下孵育5,15和30分钟
4. 通过加入1M新鲜制备的和冰冷的NaBH 4 4至100mM的终浓度来稳定反应产物。
5. 在冰上孵育反应样品30分钟
6. 将反应产物与10μl凝胶上样缓冲液混合
7. 将酵母细胞提取物中的反应产物在 15％聚丙烯酰胺凝胶，扫描凝胶并分析数据如报道（Caglayan等人，2014）。 dRP裂解酶的结果图像， FEN1切除和酵母中的DNA去腺苷酸化酶活性提取物已被报道（Caglayan等人，2014）。

代表数据

在Caglayan等人中公开了在酵母提取物中显示dRP裂解酶，FEN1切除和DNA去腺苷酸化酶活性的结果图像作为补充图5。（2014）。

笔记

如果样品变热，在连续涡旋后酵母细胞提取物中的酶活性可能丧失。根据样品，可能需要延长交替冷却步骤。

食谱

酵母蛋白胨葡萄糖腺嘌呤（YPDA）培养基（1L）
20g葡萄糖
20克细菌蛋白胨 10g细菌 - 酵母提取物
2ml 0.5％腺嘌呤硫酸盐
磷酸钾缓冲液
25mM KPO 4（pH 8.0）
裂解缓冲液
25mM Tris-HCl（pH7.5） 1mM EDTA
100 mM NaCl
10mMβ-巯基乙醇蛋白酶抑制剂片剂
10x反应缓冲液
500mM HEPES（pH7.5） 100mM MgCl 2/v/v 200 mM KCl
5 mM EDTA
20 mM DTT
凝胶加载缓冲液
95％甲酰胺 20 mM EDTA
0.02％溴酚蓝
0.02％二甲苯蓝

致谢

这项工作是由美国国立卫生研究院，国家环境健康科学研究院（授予Z01 ES050158和ES050159）的校内研究计划支持。

参考文献

Caglayan，M.，Batra，V.K.，Sassa，A.，Prasad，R.and Wilson，S.H。（2014）。在脱碱基位点碱基切除修复期间聚合酶β在补充aprataxin缺乏中的作用 < em> Nat Struct Mol Biol 21（5）：497-499
Jazwinski，S.M。（1990）。从酵母中提取提取物的准备方法Enzymol 182： 154-174。
Wang，Z.，Wu，X。和Friedberg，E.C。（1995）。检测和测量酵母的无细胞提取物中的碱基和核苷酸切除修复酿酒酵母。方法 7（2）：177-186。