材料和试剂

感兴趣的细胞系[如Montanez et al。（2007）所述分离的原代小鼠角质形成细胞]
抗体
1. pSmad2（Merck KGaA，目录号：AB3849）
2. Total Smad2/3（Santa Cruz，目录号：sc11769）
3. 与辣根过氧化物酶（HRP）缀合的山羊抗兔（Bio-Rad Laboratories，目录号：172-1011）
牛血清白蛋白（BSA）级分V（Carl Roth，目录号：8076）
氯化钙（CaCl 2）（Carl Roth，目录号：A119.1）
Chelex 100树脂（Bio-Rad Laboratories，目录号：143-2832）
胶原I（PureCol，Advanced BioMatrix，目录号：5005-B）
纤连蛋白（Life Technologies，Gibco ，目录号：33016-015）
蛋白质标准品（例如精密加蛋白万花筒标准品）（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0375）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10270-106）
最低必需培养基（MEM）（Sigma-Aldrich，目录号：M8167）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I5500）
表皮生长因子（EGF）（Sigma-Aldrich，目录号：E4127）
转移酶（Sigma-Aldrich，目录号：T8158）
磷酸乙醇胺（Sigma-Aldrich，目录号：P0503）
乙醇胺（Sigma-Aldrich，目录号：E0135）
氢化可的松（Calbiochem，目录号：386698）
胰蛋白酶粉（Life Technologies，Gibco ，目录号：27250-018）
L-谷氨酰胺（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：25030-081）
青霉素 - 链霉素（pen-strep）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15070-063）}
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：C10420）
脱脂奶粉（AppliChem，目录号：A0830）
PVDF膜（例如Immobilon-P）（Merck KGaA，目录号：IPVH00010）
重组TGFβ1（PeproTech，目录号：100-21）
Tween20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Carl Roth，目录号：0183.1）
β-Mercaptoethanol（Carl Roth，目录号：4227.3）
溴酚蓝（Carl Roth，catataog number：A512.1）
氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：P029）
碳酸氢钠（NHCO 3）（Carl Roth，目录号：6885）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Carl Roth，目录号：A135）
脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Carl Roth，目录号：T876）
甘氨酸（Carl Roth，目录号：0079）
甘油（Carl Roth，目录号：4043.1）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415）
氯化钾（KCl）（Carl Roth，目录号：HN02.3）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Carl Roth，目录号：3904）
Nonidet-P40（NP-40）（例如IGEPAL CA-630）（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
蛋白酶抑制剂混合物（例如，cOmplete）（Roche，目录号：04693116001）
磷酸酶抑制剂混合物2（Sigma-Aldrich，目录号：P5726）
磷酸酶抑制剂混合物3（Sigma-Aldrich，目录号：P0044）
2-丙醇（Carl Roth，目录号：T902.1）
Tris-HCl（Carl Roth，目录号：9090.3）
细胞类型特异性生长（参见配方）
细胞类型特异性饥饿培养基（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的细胞裂解缓冲液（参见Recipes）
标准SDS-PAGE运行缓冲液（参见配方）
2x Laemmli样品缓冲液（参见配方）
Western印迹转移缓冲液（参见配方）
TBS（参见配方）
TBS-T（参见配方）
Western印迹剥离缓冲液（参见配方）

设备

6孔板和10cm皿用于细胞培养
标准离心机离心细胞和蛋白质裂解
细胞刮刀（例如Corning细胞刮刀）（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3010）
标准SDS-PAGE和Western印迹设备
细胞培养37℃，5％CO 2用于标准细胞培养条件
使用FlowJo作为分析软件的流式细胞仪（例如BD FACS Canto）

程序

TGFβ刺激后的增殖分析（长期效应）
注意：每个条件都应该用技术三次测量。对于角质形成细胞，6孔板的一个孔足以用于FACS分析，但是取决于细胞类型，可以用更高或更低量的细胞进行测定。通过在细胞周期S期期间摄取核苷酸类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）并随后通过Click-iT化学检测来测量增殖。可以替代地使用5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）摄取。
1. 平板细胞系在完全培养基中的这种密度，所以孔将达到第二天70％的汇合（对于角质形成细胞为1.2×10 5个细胞/孔）。对于角质形成细胞，应该涂覆孔与包被培养基在37℃下30分钟，应该之前删除电镀细胞）。
2. 第二天除去培养基（无任何洗涤步骤）替换为细胞培养基（应为室温度），补充有降低的血清浓度（此处为5％FBS）和0,5或10ng/mlTGFβ1并继续在标准下培养条件（37℃，5％CO 2）。
3. 6小时后，每孔加入10μMEdU 而不改变培养基并继续培养细胞标准条件（37℃，5％CO 2）。
4. 进一步孵育细胞 8小时，然后通过胰蛋白酶消化产生单细胞悬浮液。对于胰蛋白酶消化，去除培养基并用PBS洗涤细胞一次。然后加入胰蛋白酶溶液，在标准条件（37℃， 5％CO 2），并且一旦细胞分离，通过加入收集细胞完全培养基。在使细胞离心（在900rpm下5分钟，78× g ）用PBS洗涤单细胞悬液一次，然后使用Click-iT 测定试剂盒方案。
  注意：隔离时间点可以有所不同细胞类型。建议在预实验中确定一个时间点，其中约70％的未处理的目的细胞是 EdU积极。
5. Click-iT协议（主要遵循制造商协议，可在Invitrogen网站上下载）。
  1. 在室温下用1％BSA-PBS溶液洗涤细胞一次注意：通过离心进行细胞洗涤和缓冲液更换细胞悬浮液以2,100rpm（380×g）离心2分钟，上清液和细胞在各自的新的缓慢重悬浮缓冲区。
  2. 用200μl3.7％甲醛的PBS溶液（成分 D在试剂盒中）在室温下15分钟，并通过缓冲液透化更换为200μl1x Click-iT皂苷基透化溶液（试剂盒中的组分E）并孵育15分钟
  3. 准备 Click-iT染色溶液，根据制造商方案使用PBS （参见Click-iT反应混合物表）并用此孵育细胞溶液在室温黑暗中30分钟
  4. 洗涤细胞一次用500μlClick-iT透化和洗涤缓冲液，重悬细胞在200μl的相同缓冲液中，并立即进行FACS 测量
  5. 要检测Alexa Fluor 488进行EdU标记，请使用488 nm激发用绿色发射滤光片530/30 nm或类似物（FL1 通道）。
  6. 使用未染色的细胞作为阴性对照。
  7. 确定EdU阳性细胞的百分比，识别所有细胞已经在EdU掺入期间处于细胞周期S期（=增殖细胞）。
TGFβ刺激后的pSmad检测（短期效应或显着效应）
注意：Smad蛋白的磷酸化是TGFβ受体激活经典TGFβ信号级联后的即时效应，并且将在所有细胞类型中发生。相反，随后的TGFβ下游信号传导在不同细胞类型之间可以是高度不同的。
1. 板为每个条件一个10厘米的菜。感兴趣的细胞密度应该选择10厘米的菜肴将达到70％的汇合天（对于角质形成细胞2×10 6个细胞/皿）。对于角质形成细胞培养皿应在37℃下用包被培养基包被30分钟，这应该是在电镀细胞前移除
2. 第二天血清饥饿细胞在饥饿培养基（例如饥饿KGM）中培养几小时（2-4小时）在标准细胞培养条件下
3. 然后加入5ng/mlTGFβ1 饥饿培养基和分离细胞在0,30,60和120分钟后在标准细胞培养条件下继续温育。
4. 对于细胞分离，用PBS洗涤细胞一次并在适当的溶液中裂解体积的裂解缓冲液（例如，RIPA），对于角质形成细胞，每10cm为120μl 盘）直接在冰上的板上。用细胞收集细胞裂解物刮刀和移液器向上和向下5次与200微升提示完成细胞裂解。然后以全速（10分钟，14,000rpm）离心细胞裂解物 rpm，16,800×g），并分离上清液（样品运行） SDS-page）。
5. 使用标准在10％SDS-PAGE上分离样品 Western印迹方案考虑Smad2迁移约55-60 kDa。一个带有预染色的蛋白质标准品（例如，精密加蛋白质）万花筒标准）（对于角质形成细胞，20μg 蛋白质每道是理想的。）凝胶分离后，样品转移到PVDF膜上，使用过夜罐转移和 Dunn缓冲液。 2x Laemmli样品缓冲液，标准SDS-PAGE的配方运行缓冲液，Dunn碳酸盐缓冲液包括在配方中部分
6. 对于鼠pSmad2和总Smad2/3的检测，使用以下抗体和条件：
  1. pSmad2：
    1. 在室温下用5％牛奶TBS-T封闭膜1小时在4℃下在1％牛奶TBS-T中孵育pSmad2抗体1:1000过夜。
    2. 用TBS-T洗涤膜3×15分钟，并与第二抗体在室温下孵育1小时。
    3. 在检测前用TBS-T洗涤膜3×15分钟。
  2. 总Smad2/3：
    1. 在室温下用5％BSA TBS-T封闭膜1小时在1％BSA TBS-T中将总Smad2/3抗体1：1,000孵育过夜 C。
    2. 洗涤膜3×15分钟，并与第二抗体在室温下孵育1小时。
    3. 检测前3x 15分钟洗膜。
      注意：建议检测第一个pSmad2，并且膜剥离后，检测总Smad2/3。
      对于膜剥离，在预热（50℃）下孵育膜10分钟 ℃）剥离缓冲液在50℃。然后用ddH 2 O（4×5）洗涤膜 min），然后用2-丙醇再活化膜。重复洗涤膜（4×5分钟），然后封闭。

代表数据

图1。 A.使用Click-iT EdU Alexa Fluor 488测定试剂盒的小鼠血细胞的代表性FACS直方图。将角质形成细胞与指示的TGFβ1浓度孵育6小时，然后加入10μMEdU。在8小时的EdU掺入后分析细胞以检测增殖细胞。注意增殖细胞随TGFβ1浓度增加的减少。 B.在用5ng/mlTGFβ1刺激指定的时间点后，在鼠充血细胞中检测pSmad2的代表性Western bot。

食谱

细胞类型特异性生长和饥饿培养基以及胰蛋白酶溶液（显示用于鼠角质形成细胞培养物）

角质形成细胞生长培养基（KGM）

最终工作浓度	初始库存浓度	卷。
MEM		500 ml
5μg/ml胰岛素	5mg/ml在4mM HCl中	0.5 ml
10 ng/ml EGF	200μg/ml，在PBS中	25μl
10μg/ml转移蛋白	5mg/ml在PBS中	1 ml
10μM磷酸乙醇胺	10mM在PBS中	0.5 ml
10μM乙醇胺	10mM在PBS中	0.5 ml
0.36μg/ml氢化可的松	5mg/ml的乙醇溶液	36微升
1×谷氨酰胺	100x	5 ml
1x pen-strep	100x	5 ml
8％螯合的FBS（Ca 2+ +游离）（参见配方）		40 ml
45μMCaCl 2（无菌过滤）	100 mM	225微升

将混合物过滤通过0.2μm，并在4℃下储存至多1个月

饥饿KGM

最终工作浓度
初始库存浓度
卷。

MEM

500 ml

1x pen-strep
100x
5 ml

45μMCaCl 2（无菌过滤）
100 mM
225微升

将混合物过滤通过0.2μm并在4℃下储存最多1个月
角质形成细胞胰蛋白酶（0.4％）
将0.4g胰蛋白酶粉末溶解在100ml PBS中，并通过0.2μm 过滤器灭菌。它可以在-20°C储存1年或在4℃下1个月
避免反复冻融周期
Chelated FBS
将水合Chelex 100树脂加入FBS（20g树脂，对于40ml FBS）并在4℃下搅拌1小时进一步通过过滤除去树脂将螯合FBS储存在-20℃下
角质形成细胞的包被介质
在使用前，立即稀释胶原I（30μg/ml）和纤连蛋白（10μg/ml）

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将NaCl（137mM）8g/L，KCl（2.7mM）0.2g/L，Na 2 HPO 4（10mM）1.44g/L，KH 在ddH 2 O 2中的2×PO 4（1.8mM）0.24g/L，用HCl调节pH至7.4，
补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（对于RIPA））的细胞裂解缓冲液对于RIPA缓冲液，溶解Tris-HCl（50mM，pH 7.4），NP-40（1％），脱氧胆酸钠（0.5％），SDS（0.1％），NaCl（150mM） /> （使用前加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂2和3）
标准SDS-PAGE运行缓冲液
为了制备10x运行缓冲液，溶解ddH 2 O中的Tis-HCl 30g/L，甘氨酸144g/L和10g/L SDS。
使用前稀释至1x/
2x Laemmli样品缓冲液
在ddH 2 O中溶解Tris-HCl（100mM，pH 6.8），20％甘油，2％SDS和0.01％溴酚蓝。在使用前加入β-巯基乙醇（4％）
Western印迹转移缓冲液（例如Dunn碳酸盐缓冲液）
这里使用Dunn碳酸盐缓冲液
对于1×Dunn碳酸盐缓冲液，溶解NaHCO 3（10mM）0.84g/L，Na 2 CO 3 NO 3（3mM）0.318g/L和甲醇（20％）200ml，在ddH 2 O 2中
TBS
在ddH 2 O中溶解Tris-HCl（50mM）6.05g/L和NaCl（150mM）8.76g/L并用HCl调节pH至7.5
TBS-T
补充有0.1％Tween20的TBS
Western印迹缓冲液
2％SDS
62.5mM Tris-HCl（pH6.7） 100mMβ-巯基乙醇（仅在使用前直接添加）

致谢

这项工作由马普学会资助。

参考文献

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