材料和试剂

大肠杆菌（大肠杆菌）OP50 [可从Caenorhabditis 遗传中心（CGC）获得]
抗FLAG M2亲和凝胶（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
1-溴-3-氯丙烷（BCP）（Sigma-Aldrich，目录号：B9673）
1M CaCl 2溶液（Sigma-Aldrich，目录号：21114）
蒸馏水（DNase/RNase-free UltraPure TM）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：10977-015）}
10mM dNTP混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0191）
EDTA（0.5M，pH 8.0）UltraPure TM（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15575-020）}
乙醇200标准（用于分子生物学）（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
FLAG肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
GlycoBlue TM共沉淀（15mg/ml）（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM4530）
100x暂停蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：78430）
异丙醇（2-丙醇，分子生物学）（Sigma-Aldrich，目录号：I9516）
KH sub 2 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
8 M LiCl溶液（Sigma-Aldrich，目录号：L7026）
Maxima逆转录酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EP0741）
1M MgCl 2溶液（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
1M MgSO 4溶液（Sigma-Aldrich，目录号：M3409）
Na 2 HPO 4（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
5 M NaCl溶液（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9759）
NP-40 [10％（w/v）水溶液]（Pierce Antibodies，目录号：85124）
多聚甲醛（32％溶液，EM级）（VWR International，目录号：15714-S）
锁相凝胶重（1.5ml）（5PRIME，目录号：2302810）
苯酚：氯仿：IAA（25:24:1，pH 6.6）（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9730）
蛋白酶K（〜20mg/ml）（重组）（PCR级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EO0491）
2x QuantiFast SYBR Green qPCR主混合物（QIAGEN，目录号：204154）
随机六聚体（100μM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：SO142）
核酸酶抑制剂SUPERase In （20U /μl）（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM2694）
20％SDS溶液（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9820）
3 M乙酸钠（pH 5.5）溶液（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9740）
脱氧胆酸钠储备液[10％（w/v）在蒸馏水中]（Pierce Antibodies，目录号：89904）
TRI Reagent 溶液（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9738）
1M Tris-HCl（pH7.5）UltraPure TM（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15567-027）
Triton-X 100洗涤剂溶液（Pierce Antibodies，目录号：85111）
图1中用于检测mes-4前mRNA的引物序列：正向GGATACATCAATGGAGAAATGGA（跨越外显子2和内含子3）和反向ACAACTCGCGTGAAATTTACTAC（跨越内含子3）
注意：DNA oligo已由Integrated DNA Technologies（IDT）合成。
1x M9缓冲区（参见配方）
核提取缓冲液（参见配方）
RIPA缓冲区（参见配方）
TSE 150缓冲区（参见配方）
TSE 500缓冲液（见配方）
TSE 1,000缓冲区（参见配方）
LiCl缓冲液（见配方）
TE缓冲区（参见配方）
洗脱缓冲液（见配方）

设备

1.5ml Bioruptor TPX 聚甲基戊烯管（Diagenode，目录号：M500-50）
微量离心管（1.5ml，不含RNase）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：AM12400）}
Bioruptor 标准UCD-200超声波仪（Diagenode，目录号：B01010003）
Dura-Grind ^TM不锈钢杜松组织研磨机7ml（Wheaton Scientific，目录号：357572）
实时PCR仪（例如 Eppendorf，Mastercycler ep realplex ⁴
制冷台式微量离心机
Labquake 管旋转器（Thermo Fisher Scientific，目录号：400220Q）
涡流

程序

固定和核提取
1. 在一个接种有OP50细菌（约20,000个蠕虫）的大LB琼脂平板（100×15mm）上生长同步的蠕虫群体。
2. 用冷的M9清洗板上的蠕虫。
3. 在1,200×g离心1分钟，以使蠕虫沉淀
4. 用冷M9洗涤3次。
5. 在1,200×g离心1分钟，以使蠕虫沉淀
6. 固定蠕虫与2％多聚甲醛在10ml M9缓冲液中30分钟，在室温下旋转。
7. 在1,200×g离心1分钟，以使蠕虫沉淀
8. 弃去上清液，并用10ml冷的0.1M Tris-HCl（pH 7.5）洗涤一次
9. 在1,200×g离心1分钟，以使蠕虫沉淀
10. 用10毫升冷M9缓冲液清洗蜗杆沉淀两次。
11. 在1,200×g离心1分钟以沉淀蠕虫并弃去上清液。
  注意：在这一步，你可以冻结蠕虫丸，并存储在-80°C。
12. 将蠕虫颗粒在2ml冷核提取缓冲液中重悬
13. 转移2毫升蠕虫到钢dounce（冰）和中风至少30次。
  注意：在显微镜下检查蠕虫是否被破坏。
14. 转移2毫升裂解物到两个无RNA酶的1.5毫升微量离心管和离心2分钟，在40℃，4℃。
15. 将上清转移到两个新的无RNase的1.5ml微量离心管中
16. 在4℃下以1,000×g离心5分钟以沉淀核部分。
17. 弃去上清液并用1ml冷核提取缓冲液洗涤核沉淀。
  注意：在一个不含RNA酶的1.5ml微量离心管中混合两种沉淀。
18. 在4℃下以1,000×g离心5分钟以沉淀核部分。
19. 重复步骤17和18两次
20. 在4℃下以1,000×g离心5分钟以沉淀核部分。
21. 重悬在500μlRIPA缓冲液中的核沉淀。
超声
1. 将裂解物转移到1.5ml Bioruptor TPX 聚甲基戊烯管中。
2. 在4℃下超声处理样品20分钟（设置：30秒开，30秒关，水平高320W，波频率20kHz）。
3. 在4℃下以12,000×g离心5分钟。转移上清液（含有染色质）至新的无RNA酶的1.5ml微量离心机管注意：在这一步，样品可以储存在-80°C。
免疫沉淀
1. 取1/20部分的上清液用于输入RNA提取并储存在冰上
2. 每次免疫沉淀使用30μl的抗Flag M2亲和凝胶
3. 用1ml RIPA缓冲液平衡亲和凝胶
4. 在4℃下以1000xg离心1分钟。
5. 重复步骤27和28。
6. 将步骤24的上清液加入到平衡的亲和凝胶中
7. 在4℃下孵育1小时（以8rpm连续旋转）
8. 在4℃下以1000xg离心1分钟。
9. 用1ml TSE150缓冲液洗涤亲和凝胶，并在4℃下旋转孵育1分钟
10. 在4℃下以1000xg离心1分钟。
11. 弃去上清液，用1ml洗涤亲和凝胶2次 TSE500缓冲液中，并在4℃下旋转孵育1分钟。
12. 在4℃下以1000xg离心1分钟。
13. 弃去上清液，用1ml TSE1000缓冲液洗涤亲和凝胶，并在4℃下旋转孵育5分钟。
14. 在4℃下以1000xg离心1分钟。
15. 弃去上清液并用1ml LiCl缓冲液洗涤亲和凝胶，并在4℃下旋转孵育5分钟。
16. 在4℃下以1000xg离心1分钟。
17. 弃去上清液，用1ml TE缓冲液洗涤亲和凝胶2次
18. 在4℃下以1000xg离心1分钟。
19. 弃去上清液，并使用P200移液器吸头尽可能多的缓冲液。
20. 使用200μl洗脱缓冲液从亲和凝胶洗脱蛋白质-RNA复合物
21. 在4℃下旋转孵育1小时。
22. 在4℃下以1000xg离心1分钟。
23. 转移上清液到一个新的无RNA酶1.5毫升微量离心管。
反向交联
1. 取来自步骤47的200μl上清液，并输入来自步骤25的RNA （用洗脱缓冲液至终体积为200μl）并用1处理 μl（20μg）蛋白酶K在45℃下孵育1小时。
RNA纯化
1. 向步骤48的样品中加入750μlTRI试剂溶液并涡旋30秒。
2. 加入100μlBCP，涡旋30秒
3. 在室温下孵育10分钟。
4. 在4℃下以12,000xg离心15分钟。
5. 将顶部水相转移到新的无RNA酶的1.5ml微量离心管中
6. 加入1.5μlGlycoblue ^TM和50μl的3M乙酸钠
7. 混合并加入1体积的异丙醇（通常为400-500μl）
8. 在室温下孵育5分钟
9. 在4℃下以12,000xg离心20分钟。
10. 用1 ml 70％乙醇洗涤RNA沉淀
11. 在4℃下以7,500×g离心5分钟。
12. 将沉淀重悬于44μl无RNase的UltraPure TM蒸馏水中。
DNase治疗
1. 向步骤60的样品中加入5μl10x TURBO DNase缓冲液和1μlTURBO DNase。
2. 在37℃孵育30分钟。
3. 加入450μl无RNase-Free UltraPure ^TM蒸馏水（总体积500μl）。
4. 加入500μl的苯酚：氯仿：IAA，涡旋混合
5. 将混合物转移到1.5ml Phase Lock Gel管中并在4℃下以12,000×g离心5分钟。
6. 将顶层水相转移到新的无RNA酶的1.5ml微量离心管中
7. 加入1.5μlGlycoblue ^TM和50μl的3M乙酸钠，并涡旋混合。
8. 加入1倍体积的异丙醇（通常为400-500μl），并通过涡旋混合
9. 在室温下孵育5分钟
10. 在4℃下以12,000xg离心20分钟。
11. 用1 ml 70％乙醇洗涤RNA沉淀
12. 在4℃下以7,500×g离心5分钟。
13. 重悬于12.5μl无RNA酶UltraPure TM蒸馏水中。
cDNA合成
1. 加入来自步骤73的样品，1μl随机六聚体引物，4μl 5x反应缓冲液，0.5μlRNase抑制剂，1μldNTP混合物（0.5mM 最终浓度）和1μlMaxima逆转录酶
2. 在25℃孵育10分钟，然后在37℃孵育60分钟
3. 通过在70℃加热10分钟停止反应注意：逆转录反应可以储存在-20℃。
qPCR
1. 用100μl无核酸酶的水稀释步骤76的20μl样品并在25μlqPCR反应中使用5μl作为模板（进行一式三份反应）;加入12.5μl的2x QuantiFast SYBR ^？绿色混合物，和引物至终浓度0.6μM。对于放大新生RNA，引物必须以这样的方式设计：至少一个PCR引物（正向或反向）位于a的内含子中靶基因，并且扩增子的长度为70-100bp。平均Ct值从一式三份qPCR反应中将考虑计算输入百分比。有关输入百分比的详细信息计算参见 http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html 。
2. 对于qPCR循环条件，使用QuantiFast SYBR ^®绿色混合制造商建议的参数。
  注意：表示数据的最佳方法是使用输入的百分比（见图1）。

代表数据

图1.使用针对FLAG表位的抗体和来自表达FLAG：CSR-1蛋白和对照非转基因蠕虫（无FLAG）的转基因蠕虫的核提取物的抗体获得的RNA-ChIP qPCR结果。已经设计了qPCR测定以跨越CSR-1的已知靶转录物的前mRNA的一个内含子。来自三个独立实验（生物学重复）的结果显示为输入的百分比。误差棒代表标准偏差。

笔记

该方案已经应用于表达与Flag表位融合的重组CSR-1蛋白的转基因菌株。然而，它可以与几乎任何在C中表达的Flag标记的核蛋白一起使用。 elegans 。此外，如果针对目标蛋白产生的一级抗体是可获得的，则其可以与蛋白A/G树脂交联并且代替抗Flag M2亲和凝胶使用。在这种情况下，建议选择已在ChIP实验中测试的抗体。由于RNA-ChIP测定的高背景，强烈建议在每个实验中总是使用非转基因菌株作为对照，或者如果使用针对目的蛋白产生的第一抗体，则敲除菌株。以下方案也可以用于细胞质RNA结合蛋白。在这种情况下，可以省略核提取步骤。

食谱

1x M9缓冲区
3g KH sub 2 PO 4 sub
6g Na 2 HPO 4
17 ml 5 M NaCl
1ml 1M MgSO 4在1L去离子水中的溶液
核提取缓冲液
10mM Tris-HCl（pH7.5） 2mM MgCl 2/
3mM CaCl 2
0.5％NP-40
10％甘油 100 U/ml核糖核酸酶抑制剂
1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
RIPA缓冲区
0.1％SDS
0.1％脱氧胆酸盐 1％Triton X-100 1mM EDTA
10mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 100 U/ml RNA酶抑制剂，蛋白酶抑制剂混合物
TSE 150缓冲区
0.1％SDS
1％Triton X-100 2mM EDTA 20mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 100 U/ml核糖核酸酶抑制剂
TSE 500缓冲区
与TSE 150相同，但使用500 mM NaCl
TSE 1,000缓冲区
与TSE 150相同，但使用1M NaCl
LiCl缓冲液
250mM LiCl 1％NP40
1％脱氧胆酸盐 1mM EDTA
10mM Tris-HCl（pH7.5） 100 U/ml核糖核酸酶抑制剂
TE缓冲区
10mM Tris-HCl（pH7.5） 1mM EDTA
洗脱缓冲液
10mM Tris-HCl（pH7.5） 0.5％NP-40
200 mM NaCl
300μg/ml FLAG肽
100 U/ml核糖核酸酶抑制剂

致谢

表达与3x FLAG表位融合的重组CSR-1蛋白的转基因菌株由C.Mello（University of Massachusetts，Worcester）友情提供。这项工作得到美国国家卫生研究院拨款1DP2OD006412-01（A.G。）的支持。该协议已经从我们以前的工作（Cecere等人，2014年）修改。

参考文献

Bittencourt，D。和Auboeuf，D。（2012）。通过RNA-ChIP测定分析共转录RNA加工方法 Mol Biol 809：563-577
Cecere，G.，Hoersch，S.，O'Keeffe，S.，Sachidanandam，R.和Grishok，A。（2014）。 CSR-1 RNA干扰途径对转录景观的全球影响 Nat Struct Mol Biol 21（4）：358-365。