图1.说明如何从力曲线提取不同的纳米力学性质的基本原理。该图显示了荷兰榆树病害敏感杂种"Groeneveld"中主要木质部细胞壁样品的典型力曲线，。 PeakForce QNM模式对图像中的每个像素执行非常快的力曲线。力曲线数据的分析在飞行中进行，提供具有与高度图像相同分辨率的多个纳米机械性质的图。粘附力是基线和回缩曲线的最低部分之间的垂直距离。变形是接触点和转折点之间的水平距离（表示最大压痕）。杨氏弹性模量可以通过使用Derjaguin，Muller，Toporov（DMT）模型拟合在接触点后外推回缩曲线的线性部分来提取。根据最小二乘法方法程序确定线性部分的斜率。能量耗散可以通过对两条曲线之间的面积积分来计算。

材料和试剂

阔叶树（榆树 spp。， Sorbus spp。）
戊二醛溶液，25％的H 2 O（II级）（Sigma-Aldrich，目录号：G6257）
乙醇溶液（分析试剂）
注意：它们各自通过在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中稀释96％乙醇制备的10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％ 100％乙醇。
25％戊二醛（I级）（Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
二甲苯（分析试剂）或具有较低毒性的替代性清洁剂（例如D-柠檬烯）注意：只能在正常运行和认证的通风柜中使用二甲苯或D-柠檬烯。
Paraplast plus（Sigma-Aldrich，目录号：P3683）
（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（Sigma-Aldrich，目录号：A3648）
0.1 M二甲砷酸盐缓冲液（见配方）
用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（参见配方）涂覆的圆形玻璃载玻片
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
戊二醛固定溶液（参见配方）

设备

剃刀刀片（细镊子和加热镊子）
pH计
带真空泵的除油器
培养皿
实验室干燥室
收回基本雪橇切片机（8000系列）（Bright Instrument Co.）
圆形玻璃载玻片（直径11mm，1mm厚）
幻灯片
钢AFM样品安装盘
样品胶垫
具有180°旋转尖端和弹簧常数至少5N/m（Bruker AFM探针）的硅探针MPP-12120（型号：TAP150A）
熔融石英参考样品（标称MOE 72.9 GPa）或任何其他MOE值高于70 GPa的参考样品
TGT1商用尖端表征光栅（NT-MDT Co.）
具有Nanoscope V控制器和PeakForce定量纳米机械映射模式（Bruker Corporation）的多模式8原子力显微镜

软件

NanoScope分析（版本1.40r2）（Bruker Corporation）
MATLAB（版本7）（MathWorks）

程序

从供体植物分离叶中叶样品（0.3-0.4cm×0.3-0.4cm）（图2A-B）。
将样品浸入5％（v/v）戊二醛（I级）在pH 7.2的0.1M二甲砷酸盐缓冲液中的固定溶液中，然后将其在室温下真空15分钟以从叶组织中除去空气。在4℃下将样品固定在固定溶液中6小时
在室温下，在升序的乙醇溶液系列中将样品脱水20分钟，接着以3:1,1:1和1:3（v/v）的比例分别使用乙醇和二甲苯的混合物30分钟，以纯二甲苯结束30分钟
继续以比例3：1,1：1和1：3（v/v）的二甲苯和paraplast plus的混合物在42℃下每次30分钟。
将样品浸入纯的paraplast加2-3天，并将其保存在60℃的实验室干燥室中。将样品转移到新鲜制备的paraplast中，每天两次。
将叶中叶样品嵌入paraplast加块（图2C）
用切片机切割10-15微米厚的叶中脉截面
将横截面转移到涂有（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷的圆形玻璃载玻片上的水滴。松开切片后，小心取出水，将载玻片放在载玻片上，使其在45℃下风干2小时。
在二甲苯中连续浸渍两次，每次3分钟，然后用比例为3:1,1:1和1:3（v/v）的二甲苯和乙醇的混合物漂洗3分钟，将切片脱石蜡，该过程在100％乙醇中连续漂洗两次，每次3分钟。
让横截面风干20分钟，并保持在无菌培养皿
从校准的光学显微镜图像确定尖端悬臂的尺寸，并将尖端悬臂插入探头支架。
使用PeakForce QNM在空气模式下，在干净的熔融石英表面上校准尖端悬臂的偏转灵敏度。使用单斜坡测试。接受自动输入偏转灵敏度参数的值。（熔融石英是确定刚性悬臂的偏转灵敏度的合适的参考样品，大约5N/m，这是测量MOE小于10GPa的样品所需的）。
使用具有简单谐波振荡器模型的Nanoscope热调谐功能来获得尖端悬臂的品质因数（Q值）和谐振频率（v0值）。按照Sader的弹簧常数校准方法，输入尖端悬臂的尺寸以及质量因子和共振频率的上述值，并直接计算该网站上尖端悬臂的刚度： http://www.ampc.ms.unimelb.edu.au/afm/calibration.html 。将计算的值添加到弹簧常数参数窗口中。

使用PeakForce QNM对TGT1尖端光栅的一个峰进行图像计算，并计算预期深度的尖端半径。使用尖端可能由椭圆体表面近似的事实。使用最小二乘法计算拟合的椭圆体低于预期深度。如果半径相似，请使用平均值。在其他情况下，使用另一个提示或预期不理想的提示

如果新手用户对偏转灵敏度，弹簧常数或尖端半径进行校准时遇到困难，请参阅PeakForce QNM用户指南的校准章节（可在网站上找到：http://nanopicolab.cnsi.ucla.edu/pages/publicview/manuals/PEAKFORCE_QNM_USERS_GUIDE-A.pdf 或 http://www.torontomicrofluidics.ca/cms/manuals/peak_force.pdf ）。

使用粘性垫将包含样品横截面的圆形玻璃载玻片放置在钢样品安装盘上

将钢样品安装盘与玻璃载玻片放在显微镜的扫描管上。

通过调整峰值力设定点以实现2nm的足够样品变形，在主要木质部组织内图像气管元件细胞壁碎片（图2D）。

在低接近尖端速度（约0.3-0.5μm/s）下进行细胞壁形貌（即高度），MOE，粘附，变形和能量耗散的测量。

将MOE的原始数据导入MATLAB软件。必须过滤MOE的数据，以便考虑尖端在陡峭的细胞壁表面上的光滑效应。使用表面形貌的高度数据计算高度梯度（通过函数"梯度"），并且还计算每个图像像素的表面斜率（梯度矢量和水平x，y平面之间的角度）。忽略表面坡度超过30度的值的MOE值，并从MOE的定量中除去这些值。其他纳米机械性能例如粘附性，变形和能量耗散的值似乎不受高表面斜率的影响。然而，为了与空间分布和测量的特性的统计一致，我们建议考虑粘附，变形和能量耗散的过滤数据。

图2.叶中叶分离和用于PeakForce QNM测量的初级木质部组织的制备。A.榆木完全膨胀的叶，没有叶中叶损伤。红色框表示叶中脉分离的位点。比例尺= 1cm。 B.叶中叶样品分离用于组织固定和包埋。比例尺= 1cm。 C.叶片中脉样品嵌入paraplast加块，准备切片机切片。比例尺= 1cm。 D.主要木质部组织和木质素自体荧光在气管细胞壁内。红色框表示经过PeakForce QNM测量的细胞壁片段。比例尺=100μm

代表数据

图3.在病原真菌感染的荷兰榆树耐病杂种'Dodoens'中的叶中脉气管元件的细胞壁片段表面的PeakForce QNM图像 Ophiostoma novo-ulmi /strong> strong> 。A.定位图像，用于展平高度。 B.弹性模量的定量图像。 C.粘附的定量图像。比例尺=1.6μm

图4.天然杂交物种中叶中叶气管元件的细胞壁片段表面的PeakForce QNM图像山梨 /strong> A.平整高度的定量图像。 B.弹性模量的定量图像。 C.粘附的定量图像。比例尺=1.1μm

食谱

0.1M二甲胂酸盐缓冲液（pH 7.2,500ml）将10.7g二甲胂酸钠三水合物溶解在400ml蒸馏水中
用HCl
调节pH至7.2 加入蒸馏水，使总体积为500ml
在通风橱中处理
在室温下贮存
涂有（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷的圆形玻璃载玻片
浸入圆玻璃在丙酮中滑动10分钟
在实验室干燥室中干燥
浸入3％（v/v）（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷在丙酮中15分钟在丙酮中彻底冲洗
在实验室干燥室中干燥载玻片
通过将载玻片置于1×磷酸盐缓冲盐水中的2.5％（v/v）戊二醛（II级）中1小时来激活（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷
在超纯水中洗涤载玻片并风干
1×磷酸盐缓冲盐水（1L）
将8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na 2 HPO 4，0.24g KH 2 PO 4，Na 2 HPO 4，在800ml蒸馏水中的溶液用HCl
调节pH至7.4 加入蒸馏水使总体积为1 L
在室温下贮存
戊二醛固定液[5％（v/v）]
通过在0.1M二甲砷酸盐缓冲液中稀释25％戊二醛（I级）制备仅在正确操作和认证的通风柜中使用戊二醛。

致谢

作者感谢Olivier Arnould博士分享他的MATLAB脚本用于计算TGT1尖端光栅图像的尖端半径，以及IngridČaňová博士的技术帮助。这项工作由斯洛伐克科学资助机构VEGA（1/0132/12）资助。上述程序最初描述于文献</em>中。（2013年）。

参考文献

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Sweers，K.，van der Werf，K.，Bennink，M。和Subramaniam，V。（2011）。 α-突触核蛋白淀粉样蛋白原纤维的纳米机械性质：纳米压痕，谐波力显微镜和Peakforce的比较研究QNM。 Nanoscale Res Lett 6（1）：270.