第I部分。主要方案：在不分裂的Huh7细胞培养物中的HCV细胞 - 细胞扩散

材料和试剂

Huh7细胞（来自Francis Chisari博士，The Scripps Research Institute，La Jolla，CA）（Zhong et al。，2005）
JFH-1 HCVcc（如前所述产生并通过有限稀释滴度测定定量）（Yu和Uprichard，2010; Knipe和Howley，2007）
注意：也可以使用其他感染性HCVcc克隆。
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Mediatech，目录号：MT-10-013-CV）
胎牛血清（FBS）（Hyclone，目录号：SH30910.03）
青霉素，链霉素，L-谷氨酰胺（Mediatech，目录号：MT-30-009-CI）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D4540）
1x PBS（Mediatech，目录号：MT-21-030-CV）
过氧化氢（H 2 O 2）（Thermo Fisher Scientific，目录号：H325）
AEC检测底物（BD Biosciences，目录号：551015）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
Ezetimibe（Sequoia Research Products，目录号：SRP04000e）在DMSO中制备，浓度为20mM
兔抗人CLDN1多克隆抗体（Abcam，目录号：ab63070）
兔抗人NPC1L1多克隆抗体（Santa Cruz，目录号：sc-67236）
人抗-HCV E2单克隆抗体MAb AR3A（来自Dr.Mansun Law，The Scripps Research Institute，La Jolla，CA）（Law等人，2008）
小鼠抗HCV NS5A 9E10单克隆抗体（来自Charles Rice，Rockefeller University，New York，NY）（Lindenbach等人，2005）
HRP缀合的山羊抗人（Thermo Fisher Scientific，目录号：31410），山羊抗小鼠（Thermo Fisher Scientific，目录号：31430）和山羊抗兔（Thermo Fisher Scientific，目录号：31460）。
小鼠IgG（Santa Cruz，目录号：sc-2025），兔IgG（Santa Cruz，目录号：sc-2027）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T-8787）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）
Lipofectamine RNAiMAX转染试剂（Life Technologies，目录号：13778）
OptiMEM（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：31985-070）}
50ml离心管（Dot Scientific，目录号：451-PG）
完成DMEM（cDMEM）（参见配方）

设备

96孔BioCoat胶原包被的组织培养板（Corning，目录号：356698）
BioCoat胶原包被的T75cm 2烧瓶（Corning，目录号：356485）
倒置显微镜
血细胞计数器
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
台式离心机（例如Sorvall，型号：T6000D或Eppendorf，型号：5810R）

程序

非生长Huh7细胞培养物的制备
1. 种子6,000 Huh7细胞/孔在BioCoat胶原包被的96孔板中在200μl/孔10％FBS cDMEM中。
2. 将板在37℃下在5％CO 2细胞培养箱中孵育过夜或直到细胞达到95％-99％汇合。
3. 吸出或倾析电镀培养基，并更换为200μl/孔含有1％DMSO的10％FBS cDMEM，并继续在37℃下培养细胞在5％CO 2细胞培养箱中孵育10天，改变1％DMSO， 10％FBS cDMEM。（介质更换应缓慢进行其中移液管尖端朝向孔的壁倾斜）。在此期间孵育期细胞仍然代谢活跃，但停止（Sainz和Chisari，2006）。到第10天，每个孔含有约65,000个细胞。
感染开始
1. 在2％FBS cDMEM中稀释HCVcc至50-100个病灶形成单位（ffu）/100μl。
2. 向每个孔中加入100μl病毒接种物并在37℃下孵育在5％CO 2细胞培养箱中过夜（约16小时）以允许初始病毒输入。
阻止后续的"无细胞"细胞外病毒进入
该步骤应在接种后不晚于18小时进行，以防止随后从第一轮感染细胞释放到培养基中的后代病毒感染细胞。
1. 感染后16小时移除病毒接种物，并用1×PBS轻轻冲洗
2. 加入含有10μg/ml HCV E2的10％FBS，1％DMSO cDMEM 抗体MAb AR3A加入到每个孔中，总体积为150μl/孔中和HCVcc的无细胞扩散（Barretto等人，2014; Timpe等人 al。，2008）。（可以加入另外的因子特异性抑制剂平行样本在这一点，以评估其对HCV的影响细胞间传播; 见下文F部分。）
3. 继续孵化在37℃在5％CO 2细胞培养箱中培养以允许时间（例如感染后48-72小时）发生HCV的细胞间传播。
4. 在进入D部分之前，从中收集所有培养基将样品孔转移至新的96孔板中进行分析中和，如下文E节所述。（这可以测定立即或储存于-80℃，直到可以进行测定）。
通过免疫染色可视化HCV细胞与细胞的传播
在这些条件下，多细胞HCV病灶只能通过细胞间传播形成。因此，单个HCV病灶中的HCV阳性细胞的数量可以用作细胞 - 细胞传输的读出。在这里，免疫染色被描述为可视化HCV感染的细胞，但是可以使用其他方法（例如补充方案A）。
1. 通过向每个孔中加入等体积的4％PFA来固定细胞，最终浓度为2％，并在室温下孵育25分钟。
2. 滗析并用1x PBS冲洗细胞三次
3. 通过与100μl/孔冰冷孵育阻断内源性过氧化物酶 1×含有0.3％（v/v）过氧化氢的PBS 5分钟温度（RT）。
4. 用1×PBS滗出和冲洗3次
5. 渗透和封闭细胞1小时用100μl/孔1×PBS含有 0.5％（v/v）Triton X-100,3％（w/v）BSA和10％（v/v）FBS。
6. 从封闭溶液中吸出。
7. 立即加入50μl/well适当的HCV特异性原发性抗体稀释在含有0.5％（v/v）Triton X-100和3％（w/v）BSA在室温下1小时。（例如人类抗HCV E2 MAb AR3A可以使用2.3μg/ml或小鼠多克隆血清抗HCV NS5A 9E10可以以1：500稀释使用。）
8. 倾析或吸出一抗，并用1x PBS冲洗细胞三次。
9. 用适当的HRP共轭二级培养物孵育细胞抗体（50μl/孔）在室温下孵育1小时（例如，我们检测结合的MAb AR3A 与HRP缀合的抗人抗体和9E10的1:1000稀释液接触用HRP缀合的抗小鼠的1:500稀释液）
10. 用1x PBS冲洗细胞3次。
11. 孵育细胞与30微升/孔AEC检测基板在室温下30分钟
12. 用dH 2 O 3洗涤细胞3次，加入150μl/孔的溶液 dH 2 O：甘油（1：1）。板可以在4℃下储存
13. 使用适当的显微镜量化和拍摄焦点。的每个病灶的HCV阳性细胞数是HCV细胞对细胞的读出（见图1）。
中和控制测定
为了确保在测定期间培养基中的无细胞病毒被中和，应当测定在实验培养基的培养基中感染性无细胞病毒的存在。这些样品在扩展测定结束时收获，如C4）部分所述
1. Huh7细胞培养物的制备。
  1. 种子4,000 Huh7细胞/孔在96孔细胞培养板中在200μl/孔10％FBS cDMEM中。
  2. 将板在37℃下在5％CO 2细胞培养箱中孵育过夜。
2. 吸出电镀培养基，并将培养基样品（〜200微升）转移到初始Huh7细胞单层。
3. 在24小时，吸出病毒接种物，并加入200μl/孔新鲜的10％FBS cDMEM
4. 在接种后72小时，固定细胞并进行免疫染色以检测HCV感染的细胞（如上）。
  如果在上清液中检测到感染性病毒，则不能从测定中准确地测定细胞与细胞的扩散。
评估不同因素对HCV细胞与细胞传播的影响
除了监测HCV细胞到细胞扩散的动力学之外，该测定可用于鉴定抑制病毒生命周期的这一步骤的细胞因子或抗病毒剂。
1. 抑制剂的使用。
  抑制剂对特定因素或抗病毒药物具有未知的作用机制可以在无细胞病毒时加入在步骤C2阻塞条目。在这种情况下，适当的控制应该也包括在内：
  1. "模拟"处理阴性对照样品（例如稀释剂或IgG对照）以控制非特异性抑制。
  2. 作为抑制的阳性对照细胞至细胞扩散，可以用抑制剂处理平行培养物其阻断已知为HCV细胞至细胞扩散所需的因素（例如，20μg/ml抗紧密连接蛋白抗体，30μg/ml抗NPC1L1抗体或 30μM的NPC1L1抑制剂Ezetimibe）。在没有细胞的情况下在这些HCV扩散抑制剂的存在下形成的病灶限于1-2个细胞。
    注意：在中进行此测定时主动分裂细胞（补充协议B），这些控制是特别有助于确定细胞分裂的数目，即在这些对照中的病灶的大小样品提供细胞分裂可能程度的指示有助于增加灶灶大小。
2. siRNA敲除。
  RNAi是评估细胞参与的替代方法 HCV细胞到细胞扩散的基因。在这种情况下，进行测定在沉默感兴趣的基因后，如上所述补充方案C）。在这种情况下，应该有以下控件包括：
  1. 监测和控制转染的非特异性效应。
    1. 未处理和模拟转染的对照样品。
    2. 非特异性siRNA转染的对照样品（例如siScramble或siGFP）。
  2. 作为平行抑制细胞与细胞扩散的阳性对照可以用靶向已知的因子的siRNA转染培养物（例如，紧密连接蛋白1或NPC1L1）所必需的。
  3. 在扩展测定期间，siRNA靶向的表达水平基因应当在平行样品中监测（例如，RT-qPCR和/或）免疫印迹，和/或功能测定（如果可获得的话）虽然不是这种沉默方法需要进行初步实验确定特定基因沉默的效率和动力学确保测定在最佳沉默条件下进行。也，因为感兴趣的因子可能涉及无细胞的细胞外病毒进入，病毒接种应在沉默前进行使得第一轮感染可以发生。
    注意：如果沉默在感染开始之前开始部分抑制但是，感染可能导致形成的灶的数目减少细胞到细胞扩散的读数是焦点尺寸而不是焦点数这个技术问题不应阻止细胞与细胞扩散的分析除非初始感染完全阻止。
示例结果和解释
当细胞 - 细胞扩散被阻断时，观察到仅有1-2个细胞大小的病灶。因此，在非分裂细胞培养中，由1-2个细胞组成的病灶被分类为没有扩散（图1，右图），而具有多于2个细胞的病灶被解释为由细胞到细胞扩散产生1，中间图）。通过计算不显示细胞间传播（即，1-2细胞灶）的每个孔中感染事件的百分比相对于感染事件的百分比，可以半定量地表示数据每个孔显示出细胞到细胞的扩散（即> 2个细胞灶）。或者，为了更定量地测量扩散（和不同抑制剂/细胞因子的效应），可以计数孔内每个个体焦点中的细胞数目。

图1. HCV细胞到细胞扩散测定。左图：感染后72小时的Huh7细胞单层对HCV染色。中：当细胞 - 细胞扩散允许进行时形成的典型的HCV病灶。右：当传播阻塞时观察到HCV病灶。

食谱

完成DMEM（cDMEM）
100单位/ml青霉素
100mg/ml链霉素 2mM L-谷氨酰胺

第二部分。补充协议

补充方案A：可视化HCV阳性细胞的替代策略
如上所述，免疫染色是检测HCV阳性细胞的方便的方法;然而可以使用其他方法。例如，如果需要HCV细胞至细胞扩散的实时活细胞成像，则Huh7.5-RFP-NLS-IPS报道细胞系（Jones等人，2010）可以使用。在未感染的细胞中，RFP-IPS-NLS蛋白定位于细胞质中的线粒体。感染后，HCV NS3/4A蛋白酶切割RFP-IPS-NLS离开线粒体，允许蛋白质定位于细胞核。因此，可以基于RFP从细胞质到细胞核的重新定位来实时监测细胞的感染。

材料和试剂

注意：与主协议中的相同，添加以下内容。

Huh7-5.1TRIP-RFP-NLS-IPS（来自Charles Rice，Rockefeller University，New York，NY）（Jones等人，2010）

设备

注意：与主协议中的相同，添加以下内容。

倒置荧光显微镜（例如Nikon Corporation，型号：TE2000U）

程序

按照主协议中所述进行实验，除了：

在主协议部分A（制备非生长Huh7细胞培养物）中利用Huh7-5.1TRIP-RFP-NLS-IPS细胞代替亲代Huh7细胞。
在基于RFP信号的核定位的显微镜下监测细胞与细胞的铺展（代替主要方案D节中描述的免疫染色）（参见图2的实施例结果）。由于敏感性增加，在该测定中细胞 - 细胞扩散的证据可早在感染后12小时检测。

图2.由被HCV感染的Huh7.5-RFP-NLS-IPS细胞（即核RFP）包围的Foci未感染的销售（细胞质RFP）

补充方案B：正在生长的细胞培养物中的HCV细胞至细胞扩散测定
由于技术原因，有时优选在生长Huh7细胞中进行测定（例如，当使用较高浓度的一些商业抗体制剂时，限制抑制剂浓度，叠氮化钠的毒性作用，或者更灵活地 siRNA敲低的时间）。在这种情况下，可以如上所述进行测定，具有以下修改：

材料和试剂

注意：与主协议相同。

设备

注意：与主协议相同。

程序

生长的Huh7细胞培养物的制备
1. 在测定前一天，种子12,000 Huh7细胞/孔的96孔组织培养板在10％FBS cDMEM中。（包括用于计数细胞的额外孔如下所示。）
2. 在37℃下在5％CO 2细胞中孵育烧瓶培养箱中培养过夜，然后进行如上所述的测定主协议步骤B.
细胞分裂的会计。因为细胞分裂也可以有助于增加每个焦点的细胞数目，所以在测定期间监测细胞分裂的程度是关键的。这可以通过计数在感染时和在测定结束时存在于一式三份孔中的细胞数目。在测定结束时每孔中的细胞数目与感染时每个孔中细胞数目的比率提供了在测定期间发生的细胞分裂数目的估计。结合主协议步骤F2中描述的阳性对照，直接监测细胞扩增可以建立可能纯粹来自细胞分裂的病灶的大小，从而有助于控制细胞生长的效果。

补充方案C：非生长Huh7细胞的siRNA转染反转

材料和试剂

注意：与主协议相同。

设备

注意：与主协议相同。

程序

非生长Huh7细胞培养物的制备
1. 种子〜2×10 6 Huh7细胞在BioCoat T75cm 2烧瓶中的15ml 10％FBS cDMEM中。
2. 将烧瓶在37℃下在5％CO 2细胞培养箱中孵育过夜或直到细胞达到95％-99％汇合。
3. 用20ml含有1％DMSO的10％FBS cDMEM替换培养基并在37℃下在5％CO 2细胞培养箱中继续孵育细胞每隔一天更换1％DMSO，10％FBS cDMEM。
RNAiMAX siRNA转染。
1. 在DMSO处理后14-20天，用5ml胰蛋白酶胰蛋白酶处理烧瓶在37℃下10分钟。用7ml含有DMEM的血清中和抗生素。
2. 将细胞转移到50ml离心管中，并在台式离心机中以1,000×g旋转5分钟。
3. 冲洗细胞在35毫升OptiMEM两次，收集细胞沉淀通过其间的离心。将细胞重悬于7.8×10 5个细胞/ml OptiMEM。
4. 转染混合物的制备（作为主混合物或单独转染在Eppendorf管或板格式，as 适当）。
  对于待转染的96孔板的每个孔：
  1. 将0.84μl10μMsiRNA原液与30μlOptiMEM混合。
  2. 添加1.2微升RNAiMax到siRNA-OptiMEM并轻轻混合。
  3. 在室温下孵育20分钟。
  4. 在孵育过程中，将30μl转染混合物转移至等待的96孔转染板的合适孔中。
5. 孵育20分钟后，加入90μl的细胞悬浮液到含有转染混合物和移液管的每个孔中轻轻地混合一次。（目标是重建非繁殖细胞单层〜65,000个细胞。基于上述，每口井应接受〜70,000个细胞，最终体积为120μl，含有最终siRNA 浓度为70nM，允许一些细胞损失。）
6. 在37℃下在5％CO 2细胞培养箱中孵育过夜。
7. 继续感染，如主协议步骤B2中所述。（如果沉默基因可能是无细胞胞外病毒所需的进入，建议感染文化20-24 h 在靶基因有效沉默之前的转染后）。

笔记

在每个使用者的手中，重要的是确定感染单位的数量和孵育的时间，其将导致形成足够数量的分离良好的焦点，其足够大以清楚地观察扩散。这可以通过用不同体积的病毒接种物进行中试测定并孵育不同时间段来实现。

致谢

这项工作由NIH授权R01-AI078881和R21-AI097809支持。

参考文献

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