材料和试剂

上皮细胞和成纤维细胞[参见Verghese et al。（2013），我们使用的类型，但许多其他可能适用]
生长因子减少基质胶（BD，目录号：356231）
胶原蛋白-1（BD，目录号：354236）
胎牛血清（FCS）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
DMEM（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：31966）
MEM粉末（Sigma-Aldrich，目录号：M0268）
1 M N-（2-羟乙基）哌嗪-N' - （2-乙磺酸）（HEPES）（pH7.5）
NaHCO 3
兔抗细胞角蛋白（Abcam，目录号：Ab9377）
Zymed抗体稀释液（Life Technologies，目录号：003218）
DPX（Sigma-Aldrich，目录号：317616）（固定剂）
Mayer的苏木精（任何供应商）
斯科特的自来水替代品（任何供应商）
Eosin（任何供应商）
福尔马林（任何供应商）
乙醇（任何供应商）
二甲苯（任何供应商）
胶原-1/Matrigel混合（见配方）
胶原培养基（见配方）

设备

组织培养孵育器（37℃，潮湿空气/5％CO 2）（Panasonic Corporation，Sanyo）
35mm培养皿（ibidi GmbH，目录号：81158）
E1000 Eclipse显微镜（尼康公司）
Superfrost Plus幻灯片和盖玻片（Menzel Glaser）
访问检索单元（Menarini集团）（执行自动化抗原检索的机器，具有增强的再现性）
自动染色机（IntelliPATH）（执行自动化免疫组织化学方案的机器，提供更高的再现性）

软件

Photoshop（ADOBE）

程序

球体形成
1. 等量的上皮细胞（MCF-7细胞）和成纤维细胞稳定操作的细胞悬浮在DMEM培养基/10％FCS中浓度为1×10 6个/ml。将25μl放置在a的中心 35毫米培养皿，倒置。
2. 将5ml具有10％胎牛血清的DMEM加入培养皿的盖子中以防止干燥。
3. 将其在37℃（潮湿空气/5％CO 2）下温育24小时以允许球体形成。
4. 第二天将300μl胶原-1/Matrigel混合物（保持在冰上）加入24孔板的每个孔中并孵育1小时凝胶固化。
5. 已形成紧密球体的细胞（定义作为那些可以很容易地"挑选"整体使用移液管），使用200μl移液管并置于中心的含有凝胶的孔。
  注意：修改细胞会降低细胞与细胞间的相互作用，可能会对此过程产生负面影响。
6. 在球体的顶部再加入300μl胶原-1/Matrigel混合物，并在37℃下孵育1小时。
7. 最后，将300μlDMEM加入到孔中。然后将其孵育48至96小时（37℃;加湿空气/5％CO 2）。
量化入侵
1. 使用E1000 Eclipse显微镜以预定的放大倍数在24,48和96小时获得相差图像
2. 细胞从球状体生长的侵入区域是相对于中心球状体本身的面积定量。使用Photoshop进行面积的定量。
3. 使用免疫组织化学评估侵袭性细胞（上皮或成纤维细胞）的身份
4. 对于代表性图像，量化的说明性示例，和评估各个测定之间的差异，请参阅 Verghese （2013）。
评估球体内的表达/细胞身份
1. 从孔中除去含有球状体的胶原凝胶，并在4％福尔马林中固定过夜。
2. 将它们转移至70％乙醇中，随后加工用于石蜡包埋。
3. 将多个5μm的胶原凝胶球体切片制备到Superfrost Plus载玻片上。
4. 每个球体的每5个切片在二甲苯中脱蜡并用分级乙醇再水合。
5. 然后他们在梅尔的苏木精，斯科特的自来水替代品和曙红中染色。
6. 此后，将切片在乙醇和二甲苯中脱水，安装在DPX。他们被检查以确定的水平球体具有最大的直径。
7. 前面和后面的部分之后该水平用于进行免疫组织化学检查球状体组织学和感兴趣的细胞类型内的表达。
  1. 我们使用兔抗细胞角蛋白，广谱抗细胞角蛋白抗体，以特异性标记上皮细胞。
  2. 将抗体在Zymed抗体稀释液中以1:100稀释。
  3. 使用Access Revelation Solution in进行抗原检索 Access检索单元和染色使用自动染色机（运行标准X-Cell plus方案的IntelliPATH）。（其他抗原检索协议也是适合的。）
  4. 将载玻片在苏木精中复染色，安装在DPX中，使用E1000 Eclipse显微镜拍摄图像。
  5. 有关说明性示例，请参见Verghese （2013）。

食谱

胶原-1/Matrigel混合物
将以下组分保持在冰上并混合，最终的胶原-1浓度为约4.6mg/ml，最终的Matrigel浓度为约2.2mg。胶原和基质胶的最终浓度基于以前的工作（Gaggioli等人，2007）。在混合物的制备期间，应当确保所有材料（特别是胶原和基质胶）被成功地移液，而不是保留在移液管尖端内。最终混合物应保持在冰上。我们为每个实验新鲜准备了该混合物，并试图仅使用单批次的试剂，因为批次间的变化可能是一个问题。
200μlMatrigel
400μl胶原蛋白-1
80μl胶原培养基
100μl胎牛血清（FCS）
220微升DMEM
用水加至1000μl
胶原培养基
2.5克MEM粉末（5x）
5ml 1 M HEPES（pH 7.5）
1g NaHCO 3 3/h 用水冲洗至50 ml
混合，然后通过0.2μm过滤器
灭菌

致谢

我们感谢Steve Hooper和Eric Sahai（CRUK伦敦研究所）帮助开发这种方法。这项工作得到了MRC的支持。

参考文献

Gaggioli，C.，Hooper，S.，Hidalgo-Carcedo，C.，Grosse，R.，Marshall，J.F.，Harrington，K.and Sahai，E。成纤维细胞引起的癌细胞的集体侵袭，对于前导细胞和随后的细胞中的RhoGTP酶具有不同的作用。 a> Nat Cell Biol 9（12）：1392-1400。
Hooper，S.，Marshall，J.F。和Sahai，E。（2006）。三维肿瘤细胞迁移方法酶 406 ： 625-643。
本文的研究结果表明，该方法可以有效地抑制细胞凋亡，增加细胞凋亡，增加细胞凋亡， S.（2008）。锂抑制胶质瘤细胞的侵袭; 可能涉及糖原合酶激酶-3。 Neuro Oncol 10（5）：690-699。
Verghese，ET，Drury，R.，Green，CA，Holliday，DL，Lu，X.，Nash，C.，Speirs，V.，Thorne，JL，Thygesen，HH，Zougman，A.，Hull，MA，Hanby ，AM和Hughes，TA（2013）。 MiR-26b在来自ER阳性乳腺癌的癌相关成纤维细胞中下调，导致增强细胞迁移和侵袭。 231（3）：388-399。