材料和试剂

单元格行
1. CL1-5/Flag-wtSlug稳定单元格
2. CL1-5/Flag-4SA稳定细胞
抗体
1. Flag M2抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F3165）
2. β-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A5441）
缓冲区和媒体
1. 100mg/ml环己酰亚胺（CHX）储备溶液（Sigma-Aldrich，目录号：C7698）
2. RPMI-1640培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：11875-176）
3. 胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10082147）
4. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3784）
5. 链霉素/青霉素（5,000U/ml）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15070063）
6. 丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P5280）
7. 碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
8. G418（Sigma-Aldrich，目录号：A1720）
9. 氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
10. IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
11. 原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
12. 氟化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7920）
13. 焦磷酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：221368）
14. 蛋白酶抑制剂混合物与EDTA（Roche，目录号：04693116001）
15. BCA蛋白测定试剂盒（Pierce，目录号：23225）
16. DTT（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
17. SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
18. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
19. 溴苯酚（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
20. 完整介质（见配方）
21. 蛋白裂解缓冲液（参见配方）
22. 5x样品缓冲液（参见配方）

设备

CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Forma系列II）
35-mm培养皿（Corning，目录号：430165）
1.5 ml管
标准超声仪

软件

MetaMorph软件（Molecular Devices）

程序

事先确定放线菌酮追踪的时间过程。蛋白质之间可能存在巨大差异。对于不熟悉的蛋白质，建议以4小时的间隔开始，并追踪至24小时。如果细胞暴露于20-24小时，环己酰亚胺可能对某些细胞产生细胞毒性。已知Slug是具有约40分钟的T 1/2 1/2的不稳定蛋白质（Wang等人，2009）。使用慢病毒转导制备稳定过表达Flag标记的wtSlug和不可磷酸化Slug-4SA的CL1-5细胞（Kao等人，2014）。细胞在具有400μg/ml G418的完全培养基中生长。为了比较wtSlug和Slug-4SA的转换，将这些稳定的细胞进行放线菌酮追踪测定。

在35-mm培养皿中接种约6×10 5个细胞，并将它们在CO 2培养箱中温育过夜。
在12小时温育后，除去培养基并向每个培养皿中加入含有300μg/ml放线菌酮（溶于DMSO）的完全培养基。
*放线菌酮的浓度取决于所用的细胞系。对于CL1-5细胞，300μg/ml环己酰亚胺在追踪测定的时间过程中不引起凋亡。建议开始不同浓度的放线菌酮（范围从50-300μg/ml）的细胞系测试至少8小时追逐。对于转染的细胞，为了避免次有效的放线菌酮浓度，应在转染后24小时通过蛋白质印迹在不存在或存在不同浓度的放线菌酮时测定标记蛋白的表达。
用新添加的蛋白酶抑制剂制备蛋白裂解缓冲液。一个35-mm培养皿需要约200μl裂解缓冲液。
用蛋白裂解缓冲液裂解t = 0h细胞，并将裂解物储存在-80℃冰箱中。
根据实验设计，在其他时间点（t = 1,2,3,6h）收集溶胞产物
在收集所有裂解物后，用超声波仪在冰上超声处理蛋白裂解物10次（1秒/次）。
离心裂解液在12,000 rpm在4°C 30分钟。
收集上清液并将其转移到具有相应标记物的新管中。
通过BCA蛋白测定试剂盒确定蛋白浓度
取50μg蛋白质，加入5x样品缓冲液，并在100℃孵育样品10分钟
通过SDS-PAGE测定和Western印迹（具有1:5,000稀释的抗Flag M2抗体;具有1:10,000稀释的β-肌动蛋白抗体）分析结果。
使用MetaMorph软件或其他等效软件，一式三份量化Flag和β-actin的Western谱带。

定量

在这种情况下通过MetaMorph软件实现定量。第一次用户应参考分析指南。基本上，选择测量区域并定义阈值。在Western印迹带的顶部绘制感兴趣的区域并定量其总灰度信号（这可以在图像J和任何其他图像分析软件中进行）。测量总阈值面积的值;然后计算Flag-Slug与其β-肌动蛋白的比率。每个时间点的最终Slug蛋白转换率是每个实验组在t = 0时Slug /β-肌动蛋白的百分比。之后可以创建绘图。

代表数据

Western杂交和定量图像已经在Oncogene中发表（Kao等人，2014）。有关详细信息，请参阅图2f（Kao em et al。）。（2014）。

食谱

完成媒介
RPMI-1640
10％FBS
15mM HEPES（pH 7.01）
100 U/ml链霉素/青霉素
1mM丙酮酸钠 44mM碳酸氢钠
蛋白裂解缓冲液
20mM Tris（pH7.5） 100 mM NaCl
1％IGEPAL CA-630
100mM Na 3+ VO 4
50mM NaF 食谱
1. 完成媒介
  RPMI-1640
  10％FBS
  15mM HEPES（pH 7.01）
  100 U/ml链霉素/青霉素
  1mM丙酮酸钠 44mM碳酸氢钠
2. 蛋白裂解缓冲液
  20mM Tris（pH7.5） 100 mM NaCl
  1％IGEPAL CA-630
  100mM Na 3+ VO 4
  50mM NaF... 食谱
  1. 完成媒介
    RPMI-1640
    10％FBS
    15mM HEPES（pH 7.01）
    100 U/ml链霉素/青霉素
    1mM丙酮酸钠 44mM碳酸氢钠
  2. 蛋白裂解缓冲液
    20mM Tris（pH7.5） 100 mM NaCl
    1％IGEPAL CA-630
    100mM Na 3+ VO 4
    50mM NaF......