材料和试剂

外周血单核细胞（PBMC）（新鲜或在Ficoll分离步骤后冷冻）
RPMI（HyClone，目录号：SH30027.01）
FBS（使用前热灭活）（Atlanta Biologicals，目录号：S11150）
Pen-Strep-Glutamine（100x）（HyClone，目录号：SV30082.01）
Benzonase（25×10 5 U/ml）（Pierce Antibodies，目录号：88701）
MilliQ水[无需接触烧杯或用肥皂洗涤的瓶子（由于大多数商业皂的钡含量）]
PBS（10x储备液）（Rockland，目录号：MB-008）
将牛血清白蛋白（BSA）（在0.85％NaCl中的30％w/v）（Sigma-Aldrich，目录号：A7284）
0.5M EDTA（pH8.0）（Hoefer，目录号：GR123-100）
叠氮化钠（10％w/v溶液）（Teknova，目录号：S0209）
2％多聚甲醛（PFA）（16％w/v含水储液，不含甲醇，在1x CyPBS中稀释至2％）（Alfa Aesar，目录号：43368）
马来酰亚胺-DOTA（Macrocyclics，目录号：B-272）
139-镧（氯化物盐）（Sigma-Aldrich，目录号：203521）
115-铟（氯化物盐）（Sigma-Aldrich，目录号：203440）
表型抗体（用0.1μm旋转过滤器过滤）（MIllipore，目录号：UFC30VV00）
可以使用来自Fluidigm的Ir-嵌入剂储液（目录号：201192B; Rh103-嵌入剂目录号：201103B）
基于10×皂苷的透化缓冲液（eBiosciences，目录号：00-8333-56）
完成RPMI（参见配方）
CyPBS（参见配方）
CyFACS缓冲区（参见配方）
活死皮（见配方）

设备

37°C水浴
96孔板：300μl孔体积（250μl洗涤）或1.2ml孔体积（500μl洗涤）
注意：如果使用300μl板，在每个点进行额外的洗涤步骤（重悬和离心）。
生物安全柜
离心机
校准移液器
ViCell（Beckman Coulter）或血细胞计数器计数器
CyTOF ^TM版本1质谱仪（Fluidigm Sciences）

软件

FlowJo软件
Microsoft Excel

程序

解冻PBMC
1. 将热完全RPMI培养基在37℃水浴中。每个样品将需要20ml的具有benzonase的培养基。计算所需的金额解冻所有样品，并制备单独的温热培养基的等分试样 1：10,000 benzonase（25U/ml终浓度; benzonase去除降低来自裂解细胞的游离DNA的粘度和背景）。解冻一次不超过10个样品。
2. 从液氮中取出样品，并在干冰上运输到实验室
3. 将10毫升温热的benzonase培养基放入15毫升管，为每个样品制作一个单独的管。
4. 在37℃水浴中解冻冷冻的小瓶。
5. 当细胞几乎完全解冻，携带到罩。
6. 从适当标记加入1毫升温暖benzonase培养基离心管慢慢地将细胞转移到细胞中离心管。用更多的培养基从离心管中冲洗小瓶检索所有单元格。
7. 尽快继续其余样品。
8. 在室温下在（RCF = 483）离心细胞10分钟
9. 从细胞中除去上清液，并通过轻敲管子重悬沉淀
10. 轻轻地将沉淀重悬在1ml温热的benzonase培养基中。过滤细胞通过70微米的细胞过滤器（如果需要）（即如果你观察任何团块）。加入9毫升加热的benzonase培养基到管中，使体积共计10ml。
11. 在室温下离心细胞（RCF = 483）10分钟
12. 从细胞中除去上清液，并通过轻敲管子重悬沉淀
13. 将细胞重悬在1ml CyFACS缓冲液中
14. 用Vicell（或血细胞计数器）计数细胞。计数，取20微升细胞并在Vicell计数室中用480μlCyPBS稀释。加载 Vicell作为PBMC，1:25稀释因子
15. 计算获得1百万活细胞所需的重悬浮体积。
  注意：通常，从冻结在10 x 10的样品瓶中恢复4-8 x 10 ⁶ ⁶
染色池
第一天
1. 将来自供体的100万个活细胞加入96孔的孔中盘子。对所有样品重复此操作。加入CyFACS缓冲液约600μl 并在室温下离心细胞（RCF = 483）10分钟
2. 轻轻或吸出以除去上清液，并重复洗涤步骤并用500μlCyFACS离心
3. 在金属螯合聚合物标记的CyFACS缓冲液中制备鸡尾酒抗体。充足每个样品的体积具有50μl的混合物。移入0.1μm 旋转过滤器并在台式微量离心机中离心（RCF = 14,000）在室温下10分钟
4. 轻拂或吸出即可来自第二洗涤步骤B2的上清液。加入50μl抗体混合物每个样品。吸移上下混合。在冰上孵育60分钟。
5. 加入500微升CyFACS缓冲液，然后离心细胞（RCF = 483）10 min。轻拂或吸出以除去上清液，在500μlCyFACS中重悬沉淀，并离心细胞（RCF = 483）室温下10分钟
6. 在CyPBS中进行1：3,000稀释 mg/ml活死亡马来酰亚胺-DOTA染色。每个样品加入100μl，移液混合。在冰上孵育30分钟。
7. 加入500微升CyFACS 缓冲液，然后在室温离心细胞（RCF = 483）10分钟温度。轻拂或吸出以除去上清液，重悬沉淀在500μlCyFACS中，并在室温下离心细胞（RCF = 483）10分钟温度
8. 加入100μl的2％PFA（在CyPBS中）; 移液器混合。地点在4℃过夜。由于透化和需要PFA固定 MilliQ水洗渗透压力在第二天。
第二天
1. 加入500微升CyFACS缓冲液，然后离心细胞（RCF = 805）10分钟在4℃。轻拂或吸出以去除上清液，将沉淀重悬浮 500μlCyFACS，并在4℃下离心细胞（RCF = 805）10分钟注意：在固定后，特别是在增加RCF是常见的永久化步骤。第1天的活细胞不能承受压力。
2. 在CyPBS中制备1x皂苷透化缓冲液。轻弹或吸气以从步骤9除去上清液。加入100μl的1x皂苷透化缓冲液加入每个样品，用移液管混合。在冰上孵化 45分钟。
3. 加入500微升CyFACS缓冲液，然后离心细胞（RCF = 805）在室温下10分钟。轻拂或吸出即可上清液，在500μlCyFACS中重悬沉淀，并离心细胞（RCF = 805）在4℃下10分钟
4. 在CyPBS中进行1:2000稀释的Ir-嵌入剂。加入100μl稀释的Ir-嵌入剂溶液每个样品，移液管混合。在室温下孵育20分钟。
5. 加入500微升CyFACS缓冲液，然后离心细胞（RCF = 805）10 min。轻拂或吸出以除去上清液，在500μlCyFACS中重悬沉淀，并离心细胞（RCF = 805）在4℃下10分钟。轻拂或吸出以去除上清液，并重复用500μlMilliQ水至少洗涤两次。 MilliQ水洗关键是要去除缓冲盐，这可能导致电流设置 CyTOF在实验过程中漂移
6. 在标准仪器设置程序后，在CyTOF上采集样品。收集至少一个"推"每个样品500μl。
分析数据
1. 使用FlowJo软件使用标准CyTOF模板分析数据。根据捐赠者特定的基础调整门，如果必要，控制任何背景差异或阳性染色强度。导出每个门控总体的统计信息到Excel电子表格。

食谱

完成RPMI
注意：在使用前，使用0.2μm过滤器进行灭菌。
RPMI 500 ml
50 ml热灭活的FBS
5ml Pen-Strep-Glutamine 100x储液
CyPBS
用MilliQ水稀释10倍PBS至1倍，
CyFACS缓冲区
1x含0.1％BSA的CyPBS
2mM EDTA和0.05％叠氮化钠在MilliQ水中制造
注意：不要使用FBS！
活死病
5mg/ml装载有139-镧*或115-铟*的马来酰亚胺-DOTA *使用天然丰富的金属氯化物盐; > 95％规定同位素; 痕量金属纯99.99％
将41.5mg/ml的固体DOTA-马来酰亚胺溶解在含有25mM金属（III）盐的硝酸（100ml 3％v/v硝酸/10ml水）中酸化的L-缓冲液（Fluidigm）或MilliQ水中。在室温下孵育15分钟，然后等分并在-20℃下冷冻 41.5mg/ml对于DOTA马来酰亚胺为50mM。 DOTA：金属的2:1摩尔比旨在减少/消除条形码试剂中的未螯合金属。
注意：每一批新的金属负载的马来酰亚胺-DOTA应该滴定，以最佳分辨率活对死细胞，具有最小的背景。因此，最终工作浓度和最终稀释度可能因批次而略有不同。

致谢

我们要感谢NIH拨款S10RR027582,5U19AI057229和5U19AI090019的资金。我们还要感谢Evan Newell博士的初始协议开发（Newell等人，2012年）。

参考文献

Maecker，H. T.，McCoy，J. P.和Nussenblatt，R。（2012）。人免疫学项目的免疫表型标准化。 Nat Rev Immunol 12（3）：191-200。
Newell，E.W.，Sigal，N.，Bendall，S.C.，Nolan，G.P.and Davis，M.M。（2012）。按飞行时间的细胞计数显示组织细胞因子表达和连续区内的病毒特异性细胞壁 CD8 ⁺ T细胞表型。免疫 36（1）：142-152。