材料和试剂

甲醇（HPLC级）
吡啶试剂Plus> 99％（Sigma-Aldrich，目录号：P57506）
H 2 O（HPLC级）（Merck KGaA）
乙腈（HPLC级）
HPLC溶剂A（参见配方）
HPLC溶剂B（参见配方）

设备

0.5 ml聚丙烯管
HPLC 2ml玻璃小瓶和200μl玻璃插入物
HPLC系统，带有自动进样器（Agilent，型号：1200）（图1）

图1.配有自动进样器和标记为FLD＃1和FLD＃2的两个荧光检测器的Agilent 1200 HPLC系统
两个HPLC荧光检测器（Agilent，型号：1200）（见注1）
原始的Agilent 1200检测器对于300-600nm的发射波长提供足够的灵敏度，然而对于较长波长，灵敏度快速下降到零。此问题也适用于较新的1260版本的检测器。由于对较长波长的灵敏度对于检测几种血红素/叶绿素前体是必需的，所以在两个检测器中用R928光电倍增管（Hamamatsu，目录号：R928）替换原始的Agilent光电倍增管。该修改显着地改善了在整个波长范围内的灵敏度，并且显着提高了对> 600nm的波长的灵敏度。光电倍增管的更换由Agilent技术服务提供。
台式离心机（Eppendorf，MiniSpin plus）
反相柱（ReproSil 100 C8-AB，5μm粒径，4×250mm）（Dr.Maisch，目录号：r15.8b.s2504）

程序

该方案需要在指数生长期的2ml蓝细菌细胞培养物。该方案对于在液体培养基BG11（Rippka等人，1979）中在30℃下生长的蓝细菌集胞藻PCC 6803非常好，其光密度为750nm〜 0.4（见注2）。 BG11培养基经常用于各种蓝细菌菌株，其包含光自养生长所需的大分子和微量元素的平衡混合物，其制备在Rippka等人（1979）中有详细描述。
所有进一步的步骤应在暗光或绿光下进行，以防止光不稳定四吡咯的降解。或者，管可以由铝箔覆盖。
通过在室温和最大速度（≥12000xg/g）离心5分钟收获细胞。除去上清液并将细胞重悬在200μl的超纯H 2 O中。转移细胞溶液到500微升管，再次旋转细胞，小心地通过移液器移除所有的水。在这一点上，细胞可以在液氮中冷冻并在-70℃下储存长达一个月
重悬从步骤3结束的沉淀在25微升的超纯水，然后加入75微升的甲醇，彻底混合和孵育在黑暗和室温下15分钟提取四吡咯。通过以最大速度离心5分钟来沉淀细胞碎片
转移上清（〜90微升）到一个新的500微升管
从步骤3的末端重悬在20μl的超纯水中的沉淀，加入80μl的甲醇，充分混合并在黑暗中和在室温下再次孵育15分钟。通过以最大速度离心5分钟来沉淀细胞碎片
池上清在500μl管中的上清液（〜180μl），充分混合并再次离心5分钟，以最大速度，以清除任何痕迹的细胞碎片。将上清液转移到200μl插入片段，并立即注入HPLC系统
在反相柱上用在0.25M吡啶（溶剂A）中的35％甲醇和15％乙腈和在乙腈中的50％甲醇作为溶剂B进行分离。用溶剂B的梯度（35至50％，在5分钟内）洗脱四min），然后在40℃下以0.8ml/min的流速在30分钟内加入50至64％的溶剂B（表1）。程序通过柱洗涤（36-45分钟）和平衡（36-45分钟）继续。

表1.设置单次运行的HPLC泵

时间（分钟）
溶剂B的％

0
35

5
50

35
64

36
100

45
100

46
35

51
35
每次运行使用100％的溶剂B完成10分钟以洗出更疏水和丰富的颜料如类胡萝卜素的叶绿素。该柱最终用35％的溶剂B平衡5分钟（对于完整的泵程序，表1）。

通过其特异性荧光发射最大值检测洗脱的颜料。荧光检测器的设置，洗脱时间和单个前体的激发/发射最大值总结在表1中，并且还在图2中图示。

表2.荧光检测器的设置和可检测的血红素/叶绿素前体的列表，包括它们的激发和发射最大值和近似洗脱时间

检测器	检测器设置Ex/Em（nm），时间	前体，Ex/Em最大值（nm）	洗脱时间
FLD＃1	400/620，0-10分钟	粪卟啉IX 400/420	6分钟
	440/660，11-22分钟	DV ^a -chlorophylide 440/670	17分钟
		MV ^b - 叶绿素 440/670	18分钟
		DV-原叶绿素440/640	20分钟
		MV-原叶绿素440/640	21分钟
	400/630，13-30分钟	原卟啉IX 400/630	26分钟
FLD＃2	416/595，0-30分钟	Mg原卟啉IX 416/595	18分钟
FLD＃2		Mg原卟啉IX ME ^c 416/595	24分钟

- -
b -monovinyl
c-单甲基酯

代表数据

图2.从蓝细菌集胞藻PCC 6803提取的分离的前体的代表性色谱图。 A.由第一荧光检测器（FLD）记录的色谱图。 B.由第二FLD同时记录的色谱图。 FLD＃1和＃2的激发和发射波长的设置显示在每个色谱图的上方。圆括号中的数字表示为给定波长设置的FLD灵敏度（增益;最大值= 16）（见注3）。 Copro III =粪卟啉IX; DV-PChlide =二乙烯基 - 原叶绿素; MV-PClide =单乙烯基 - 原叶绿素; DV-Chlide =二乙烯基 - 叶绿素; MV-Chlide =单乙烯基 - 叶绿素;原Ⅸ-原卟啉IX; Mg-Proto = Mg-原卟啉IX; Mg-Proto ME = Mg-原卟啉IX单甲酯。

笔记

该协议应使用任何HPLC系统与二元或四元泵系统和至少一个荧光检测器足够敏感的较长波长（高达680 nm）。检测整个光谱前体使用具有一个荧光检测器的系统，每个样品需要测量两次，具有不同的激发/发射波长设置
除了蓝细菌集胞藻PCC 6803之外，所描述的方案已经被成功地测试用于绿藻Chlamydomonas reinhartii ，Physomitrella ，植物拟南芥和大肠杆菌。鬼卟啉IX和原卟啉IX实际上在任何生物体中都是可检测的
安捷伦荧光检测器的灵敏度可设置为1-16（最大）。这个特定的设置（数字）是安捷伦探测器的特定设置，但是几乎任何HPLC荧光检测器都可以实现类似的灵敏度增加/减少。

食谱

HPLC溶剂A
35％甲醇和15％乙腈的0.25M吡啶溶液
HPLC溶剂B
50％甲醇/乙腈

致谢

这个研究项目得到捷克教育，青年和体育部Algatech（CZ.1.05/2.1.00/03.0110）和Algain（EE2.3.30.0059）项目的支持。

参考文献

Knoppova，J.，Sobotka，R.，Tichy，M.，Yu，J.，Konik，P.，Halada，P.，Nixon，P.J.and Komenda，J.（2014）。发现参与光合系统II中的光系统II装配的早期步骤的叶绿素结合蛋白复合物。植物细胞 26（3）：1200-1212
Rippka，R.，Deruelles，J.，Waterbury，J.B.，Herdman，M。和Stanier，R.Y。（1979）。蓝藻菌纯培养物的通用分配，菌株历史和特性 J Gen Microbiol 111（1）：1-61。