材料和试剂

3周龄拟南芥植物
甘露醇（BDH Prolabo，目录号：25311）
CaCl 2（POCH，目录号：M00015143）
KCl（USB，目录号：20598）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（LabEmpire，目录号：MES503）
NaCl（POCH，目录号：BA4121116）
聚乙二醇（PEG）4000（Sigma-Aldrich，目录号：81240）
纤维素酶（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：16419）
Macerozyme（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：28302）
GenElute HP质粒小量制备试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：PLD35）
苄基氧基羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸，Z-Leu-Leu-Leu-al（MG132）（Sigma-Aldrich，目录号：M7449）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
HEPES缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
MgCl （USB，目录号：18641）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
酶溶液（见配方）
W5（见配方）
W1（见配方）
MMg（请参阅配方）
40％PEG（见配方）
蛋白分离缓冲液（参见配方）

设备

光学显微镜（尼康公司）
血球计（Sigma-Aldrich）
胶带（Scotch ^® Magic ^TM）
不锈钢钳（Sigma-Aldrich）
剪刀
10 ml移液器
50ml管子
90 mm培养皿
Amicon Ultra-15离心过滤器单元（Millipore）
NanoDrop分光光度计
台式离心机
水平振动器

程序

原生质体分离
1. 使用镊子，收获拟南芥的5-6个成熟叶，除去叶柄。
2. 叶的近轴表面放在一条胶带上，叶片变平（图1A-B）
3. 第二片胶带以有限的压力施加，捕获叶之间（图1C）。压力会很大损害叶子，太小的压力将导致不良的表皮去除有效性。
4. 三明治放置在顶面上并通过拉开上侧的胶带将胶带分开，开始（图1D-E）（见注2）。
  
  图1.准备拟南芥叶用于原生质体分离。 A. 3周龄的Aradodopsis thaliana ; 是。叶片表皮去除的一步一步程序磁带
5. 在叶子周围切割带并在室温下放置酶溶液在培养皿中，暴露的叶肉向下。磁带不应该浸没在溶液中，但漂浮在其顶部。叶肉细胞在30℃下轻轻摇动（55rpm）消化60分钟（见注3）
6. 消化后取出胶带，将细胞在相同条件下再放置5分钟（见注4）。
7. 使用10ml移液管原生质体转移到50ml管中并置于冰上
8. 将原生质体离心3分钟（150×g，4℃）并洗涤两次用W5缓冲液。小心不要重悬原生质体突然。在第二次洗涤步骤后，将原生质体重悬浮于1ml MMg解决方案。在血细胞计数器的帮助下计算原生质体并用含有MMg的100μl稀释至最佳浓度为2×10 4个细胞解决方案（见注释5-7）。
9. 将5-10μg编码标签 - 蛋白质融合物的质粒DNA与2ml eppendorf管（参见注释8）标记。
10. 将转移到MMg培养基中的100μl分离的原生质体该管使用移液管尖端，尖端尖端被切掉
11. 使用吸头尖端的尖端切断110微升的PEG 溶液。将溶液温和混合并在室温下放置15分钟在水平位置（见注9）
12. 孵育后，加入450μl的W1 将缓冲液加入试管中以稀释PEG溶液，混合离心3分钟，300×g
13. 除去上清液并将收获的原生质体重悬于300μlW1溶液中
14. 将转染的原生质体在22℃下孵育过夜水平位置在黑暗中的蛋白质表达。这很重要在此阶段不扰乱原生质体
15. 从这一点原生质体可用于各种蛋白质分析技术（激酶测定，in vivo 蛋白质降解测定，蛋白质亚细胞定位，BiFC和FRET分析）（Ludwikow等人，2014）。这里我们显示植物蛋白的体内降解测定。
原生质体中的体内降解测定
1. 在黑暗中过夜温育（如步骤A14中所示）用50μMMG132（蛋白酶体抑制剂）或模拟物处理原生质体用0.1％DMSO处理6小时
2. 在短暂离心（300×g，RT）后，除去上清液，将细胞重悬浮在100μl蛋白质分离缓冲液中破碎。
3. 使用NanoDrop分光光度计测定蛋白质浓度。
4. 通过SDS-PAGE分离制备的样品，并通过蛋白质印迹进一步分析。

代表数据

图2.MG132处理增加了在abi1td原生质体中的ACC合酶6蛋白积累

用5μg编码StrepTag-ACS6的DNA质粒转化分离自WT Col-0和emI ABI1敲除株（abi1td ）的原生质体。转化的原生质体用50μMMG132或等体积的DMSO（模拟对照）处理6小时，然后收获。用抗StrepTag抗体的Western印迹证实了StrepTag-ACS6蛋白的存在。所示的Western印迹是至少三次独立实验的代表。考马斯染色证实蛋白负载相等（Ludwikow等人，2014）。

笔记

本协议适用于欧洲油菜原生质体分离和转化
为了避免叶肉细胞损伤（作为深绿色斑点可见），在使用胶带时不要使用太大的压力
不建议消化叶子超过60分钟。原生质体在这一点上的产量不会增加，但它们失去活力
如果一小时消化不能从胶带碎片中释放所有叶肉细胞，可以在酶溶液中温和浸渍几次，以增加原生质体产量。
使用摆动转子进行离心。
离心时保持低的加速和减速值。
通过轻轻摇动试管重悬原生质体
使用血细胞计数器获得准确和可重复的结果
大量的质粒DNA降低转化效率，因此保持体积在10μl左右。低转化效率通常是低质量质粒DNA的结果

食谱

酶溶液（10ml）
1.2％的纤维素 0.4％macerozyme
0.4M甘露醇 20 mM KCl
20 mM MES
dH 2 2 O 过滤灭菌
在55℃孵育10分钟
准备新鲜，不要存放
W5（50ml） 154 mM NaCl 125mM CaCl 2。 5 mM KCl
2 mM MES
dH 2 2 O 过滤灭菌，高压灭菌
储存在4°C
W1（10ml）
0.5 M甘露醇 20 mM KCl
4 mM MES
dH 2 2 O 过滤灭菌，高压灭菌
储存于4°C，但不超过2周
MMg（10ml）
0.4M甘露醇 15mM MgCl 2·h/v 4 mM MES
dH 2 2 O 过滤灭菌，高压灭菌
储存于4°C，但不超过2周
40％PEG（10ml） 4 g PEG 4000
200mM甘露糖 100mM CaCl 2
过滤灭菌，高压灭菌
储存在4°C，但不超过3周
蛋白分离缓冲液
20mM HEPES（pH7.5） 10mM MgCl 2/
1 mM DTT
1mM PMSF
蛋白酶抑制剂
dH 2 2 O 储存于-20°C

致谢

这项工作得到COST行动FA0605项目682/N-COST/2010/0，国家科学中心赠款（5615/B/P01/2010/39，DEC-2012/05/B/NZ3/00352，DEC-2011/03/N/NZ3/01796）和POLAPGEN批准号 WND-POIG.01.03.01-00-101/08。该方案改编自Wu等人。（2009）。

参考文献

Ludwików，A.，Ciesla，A.，Kasprowicz-Maluśki，A.，Mitula，F.，Tajdel，M.，Galganski，L.，Ziolkowski，PA，Kubiak，P.，Malecka，A.，Piechalak，，Szabat，M.，Gorska，A.，Dabrowski，M.，Ibragimow，I。和Sadowski，（2014年）。拟南芥蛋白磷酸酶2C ABI1与I型ACC合酶相互作用，并参与臭氧诱导的乙烯生物合成。 Mol Plant 7（6）：960-976。
Wu，F.H.，Shen，S.C.，Lee，L.Y.，Lee，S.H.，Chan，M.T.and Lin，C.S。（2009）。 Tape-Arabidopsis Sandwich - 一种更简单的拟南芥原生质体分离方法植物方法 5：16.